| Project/Area Number |
23KJ0409
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| Research Category |
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 国内 |
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| Review Section |
Basic Section 43010:Molecular biology-related
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
秋山 奈穂 東京大学, 工学系研究科, 特別研究員(DC2)
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| Project Period (FY) |
2023-04-25 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥2,000,000 (Direct Cost: ¥2,000,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,000,000 (Direct Cost: ¥1,000,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,000,000 (Direct Cost: ¥1,000,000)
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| Keywords | tRNA / RNA修飾 / 翻訳 / 遺伝暗号 / 構造解析 |
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| Outline of Research at the Start |
tRNAのアンチコドン1字目(34位)には様々な転写後修飾が施され、mRNA上のコドンの適確な読み分けに寄与する。原核生物はAUAコドンを専門に解読するtRNAIle2を持ち、その34位には生物種によって様々な修飾塩基が見られる。本研究では、これらのバラエティーに富んだtRNA34位修飾が正確かつ効率的なAUAコドンの読み取りを可能にする仕組みを明らかにする。特にtRNAがリボソーム上でコドンを認識する場面に注目し、コドン－アンチコドン領域周辺のmRNAやrRNAの関与を調べることで、tRNA修飾の新たな機能実証を目指す。
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、tRNAアンチコドン修飾が関与する原核生物でのAUA コドン解読の分子機構を明らかにする。これまでの成果により、アンチコドン1字目のシチジン修飾(C*34)側鎖は、周囲のmRNAやrRNAと相互作用を生じることでtRNAIle2によるAUA コドンの解読効率に寄与する可能性が示唆された。C*34 側鎖とmRNA間の相互作用の重要性を詳しく検証するため、まず合成mRNA を用いた翻訳効率の測定を試みた。C*34 側鎖とmRNA間に形成される水素結合を変化させるため、官能基置換を加えた化学合成mRNAの無細胞翻訳系を最適化した。その際、レポータータグ配列を翻訳させ、生物発光シグナルを定量することで翻訳量の変化を検出した。その結果、官能基置換を行うと翻訳量が減少したが、この変化はテストコドンがAUA以外の場合も観察された。これはmRNAの官能基置換がAUAテストコドン以外のコドン解読に大きく影響することが原因であると考えられる。次に、C*34とmRNAの相互作用の影響を調べるため、C*34側鎖近傍の16S rRNA残基の変異による翻訳活性の変化を観察することを試みた。まず、ゲノムからrRNAオペロンを完全欠損させた大腸菌株に変異16S rRNAをプラスミド相補することによって、リボソーム変異株の作成に成功した。作成したリボソーム変異株に対し、さらにanti-SD配列の変異を加えて、相補的な改変SD配列を有するレポーター遺伝子のみを翻訳させる直交翻訳系の確立を試みた。残念ながら、レポーター上のAUAコドンの数と翻訳量に相関はみられなかった。原因として、直交性の低さによるバックグラウンド翻訳量の多さが挙げられる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
これまでC*34とmRNA/rRNA間の相互作用については、非酵素的なtRNA結合アッセイでのみ検証されてきた。そこで今年度は、無細胞翻訳系や直交翻訳系を用いて実際の翻訳過程における検証を試みた。その結果、rRNA変異体の作成や系の最適化を進めることができたが、AUAコドン特異的な翻訳の変化を捉えるには至らなかったため。
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| Strategy for Future Research Activity |
今年度は、現時点での成果をまとめ論文投稿に至ったこと、新たに発見されたシチジン修飾の機能解析を進められたこと等から当初予定していた研究計画通りではないもののAUAコドン解読の分子機構解明に向けて一定の成果があった。来年度は、特に直交翻訳系についてanti-SD配列の最適化を行うなどして改善を進めつつ、主に新規シチジン修飾のキャラクタリゼーションを進める方向で計画を変更・発展させたいと考えている。具体的には、構造解析や非酵素的なtRNA結合アッセイにより新規シチジン修飾についても周囲のmRNA/rRNAとの相互作用の有無などを調べ、C*34の化学構造とAUA解読機構の関連をより詳しく明らかにしていきたい。
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