改変アミノアシルtRNA合成酵素群を用いたNアルキルペプチド翻訳遺伝暗号の構築

Research Project

Project/Area Number	23KJ1037
Research Category	Grant-in-Aid for JSPS Fellows
Allocation Type	Multi-year Fund
Section	国内
Review Section	Basic Section 43030:Functional biochemistry-related
Research Institution	University of Yamanashi
Principal Investigator	高守幸男山梨大学, 医工農学総合教育部, 特別研究員(DC2)
Project Period (FY)	2023-04-25 – 2025-03-31
Project Status	Granted (Fiscal Year 2023)
Budget Amount *help	¥2,000,000 (Direct Cost: ¥2,000,000) Fiscal Year 2024: ¥1,000,000 (Direct Cost: ¥1,000,000) Fiscal Year 2023: ¥1,000,000 (Direct Cost: ¥1,000,000)
Keywords	アミノアシルtRNA合成酵素（aaRS） / Nアルキルペプチド / 遺伝暗号拡張技術 / PUREシステム / in vitro virus / mRNAディスプレイ / SELEX / Directed evolution
Outline of Research at the Start	遺伝暗号拡張技術（genetic code expansion）と、微生物由来の再構成型のin vitro転写・翻訳共役システム（Polypeptide-synthesis Using Recombinant Elememts system、PUREシステム）などを用いて、微生物由来の改変アミノアシルtRNA合成酵素（aaRS）群を用いたNアルキルペプチド翻訳遺伝暗号の構築を目指す。
Outline of Annual Research Achievements	アミノアシルtRNA合成酵素（aminoacyl-tRNA synthetase、aaRS）群を用いたNアルキルペプチド翻訳遺伝暗号の構築を目指して、アミノアシルtRNA合成酵素によるNアルキルアミノアシルtRNA調製ならびにNアルキルペプチド翻訳の活性評価を試みた。具体的には、大腸菌由来の再構成型のin vitro転写・翻訳共役システム（Protein synthesis Using Recombinant Elements system、PUREシステム）と遺伝暗号拡張技術（genetic code expansion）を用いて、アミノアシルtRNA合成酵素によるNアルキルアミノアシルtRNA調製ならびにNアルキルペプチド翻訳の活性をMALDI-TOF質量分析で評価した。その結果、２０種類の内１３種類のアミノアシルtRNA合成酵素についてNアルキルアミノアシルtRNA調製ならびにNアルキルペプチド翻訳を検出することに成功した。更に、２０種類の内の残り７種類のアミノアシルtRNA合成酵素を用いたNアルキルペプチド翻訳遺伝暗号の構築についても、Nアルキルペプチド翻訳の活性を検出できなかった原因となる生体分子の候補を同定した。また、in vitro virus（mRNAディスプレイ）法と組み合わせて調製した数兆種類のDNAコード化ライブラリー（DEL）からの分子進化工学的スクリーニング（Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment、SELEX）を行い、NGS解析を行なった結果、がんに関わる創薬標的タンパク質に対する完全新規の環状Nアルキルペプチドを複数同定することにも成功した。本研究成果は、日本薬学会第144年会で成果発表を行なっている。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 大腸菌由来の再構成型のin vitro転写・翻訳共役システム（Protein synthesis Using Recombinant Elements system, PUREシステム）と遺伝暗号拡張技術（genetic code expansion）を用いて、アミノアシルtRNA合成酵素によるNアルキルアミノアシルtRNA調製・Nアルキルペプチド翻訳の活性をMALDI-TOF質量分析で評価した結果、２０種類の内１３種類のアミノアシルtRNA合成酵素についてNアルキルアミノアシルtRNA調製・Nアルキルペプチド翻訳を検出することに成功し、更に、in vitro virus (mRNAディスプレイ)法と組み合わせて調製した数兆種類のライブラリーからの分子進化工学的スクリーニング（SELEX）法により新規環状Nアルキルペプチドを同定することにも成功したため。そして、本研究成果を、日本薬学会第144年会で成果発表を行なったため。
Strategy for Future Research Activity	これまでに、アミノアシルtRNA合成酵素群を用いたNアルキルペプチド翻訳遺伝暗号の構築を目指して、大腸菌由来の再構成型のin vitro転写・翻訳共役システム（Protein synthesis Using Recombinant Elements system, PUREシステム）と遺伝暗号拡張技術（genetic code expansion）を用いて、アミノアシルtRNA合成酵素によるNアルキルアミノアシルtRNA調製・Nアルキルペプチド翻訳の活性をMALDI-TOF質量分析で評価した結果、２０種類の内１３種類のアミノアシルtRNA合成酵素についてNアルキルアミノアシルtRNA調製・Nアルキルペプチド翻訳を検出することに成功した。更に、in vitro virus（mRNAディスプレイ）法と組み合わせて調製した数兆種類のライブラリーからの分子進化工学的スクリーニング（SELEX）法により新規環状Nアルキルペプチドを同定することにも成功した。そこで今後は、改変アミノアシルtRNA合成酵素群を用いたNアルキルペプチド翻訳遺伝暗号の構築を目指していく予定である。