| Project/Area Number |
23KJ1255
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| Research Category |
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 国内 |
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| Review Section |
Basic Section 90110:Biomedical engineering-related
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
福手 淳平 京都大学, 生命科学研究科, 特別研究員(DC2)
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| Project Period (FY) |
2023-04-25 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥2,000,000 (Direct Cost: ¥2,000,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,000,000 (Direct Cost: ¥1,000,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,000,000 (Direct Cost: ¥1,000,000)
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| Keywords | DNA二重らせん / ねじれ / トルク / 核小体 / リボソームDNA / RNAポリメラーゼ |
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| Outline of Research at the Start |
本研究では、ゲノムDNAのねじれを操作することで疾患を治療する「標的ツイスティング技術」を開発することを目指す。先行研究により、DNAにねじれが生じるための条件の１つである「分子モーターによるトルクの発生」は検証されてきたが、もう１つの条件である「DNA軸回転の局所的な拘束」が細胞核内において生じる仕組みは未だ明らかでない。本研究では、自己集合タンパク質が重りとして働くことでDNA軸回転を拘束するとの仮説を立て、ねじれたDNAに対する蛍光イメージングおよびシーケンス解析を用いて仮説を検証する。さらに、重りタンパク質を人工的に作成し、疾患の原因遺伝子に誘導することで、標的ツイスティングに挑む。
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| Outline of Annual Research Achievements |
本年度は、細胞核内の力学環境におけるunder-twisted DNA（二重らせんのねじれ角が小さいDNA）の発生機構の解明を目指した。まず、under-twisted DNAのマーカー分子としてビオチン化ソラレンに着目し、ビオチン化ソラレンがunder-twisted DNAに優先的に結合することをin vitroアッセイにより確かめた。続いて、ビオチン化ソラレンを用いて細胞内のunder-twisted DNAをin situで蛍光標識する手法を発展させた。そして、細胞核内のタンパク質に対する免疫蛍光染色および特定のDNAに対するin situハイブリダイゼーション解析を行い、格子構造化照明蛍光顕微鏡による超解像イメージングを実施することで、核小体内のリボソームDNAにおいてunder-twisted DNAが生じることを見出した。さらに、核小体内におけるunder-twisted DNA発生機構を解明するため、核小体構成タンパク質に対して摂動を与えた時のunder-twisted DNAの空間分布の変化を検証した。その結果、核小体内においては、RNAポリメラーゼIがトルクを発生するとともに、nucleophosmin集合体がDNAの軸回転を拘束することで、under-twisted DNAの発生を誘導することが明らかとなった。本研究から、特定のタンパク質集合体の結合を介して、DNAのねじれ角が力学的に制御される機構が存在する可能性が示された。本成果を応用することで、疾患遺伝子においてunder-twisted DNAの発生を誘導する「標的ツイスティング技術」を開発することが可能となると考えられる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
受給者はunder-twisted DNAの蛍光イメージングを行うことで、核小体内の力学環境におけるunder-twisted DNAの発生機構を明らかとすることに成功した。また、本成果をまとめた論文は、Communications Biologyに採択されたほか、複数の国際・国内学会で発表され、高い評価を受けている。以上より、力によるDNA二重らせん構造の変化を利用した遺伝子治療技術の開発に向け、着実に成果を挙げていると判断されるから。
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| Strategy for Future Research Activity |
標的ツイスティング技術の開発に向け、まず、DNAの軸回転を拘束する「重り」として働く核内タンパク質を選抜することを目指す。そのために、nucleophosminをはじめとした候補タンパク質の野生型・変異型を発現・精製した後、in vitro転写系に添加し、under-twisted DNAの発生量を検証することで、最適な重りタンパク質を選抜する。次に、得られた重りタンパク質を細胞内で発現させることで、任意の場所でunder-twisted DNAを発生させることを試みる。最後に、Under-twisted DNAに対する蛍光イメージングおよびシーケンス解析を行うことで、標的個所においてunder-twisted DNAが発生していることを確かめる。
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