Exploring the origins of root-nodule symbiosis: Functional analysis of rhizobial effectors governing primitive rhizobial symbiosis

• Project/Area Number: 23KK0108
• Research Category: Fund for the Promotion of Joint International Research (International Collaborative Research)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Review Section: Medium-sized Section 38:Agricultural chemistry and related fields
• Research Institution: Tokyo University of Agriculture and Technology
• Principal Investigator: 岡崎 伸 東京農工大学, (連合)農学研究科(研究院), 教授 (40379285)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): ラトゥ サフィラタサナーバス 東京農工大学, (連合)農学研究科(研究院), 特任助教 (00985004) ; 蘭 正人 岩手大学, 農学部, 特任研究員 (10984073) ; 佐藤 修正 東北大学, 生命科学研究科, 教授 (70370921) ; 下田 宜司 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構, 生物機能利用研究部門, 上級研究員 (80415455)
• Project Period (FY): 2023-09-08 – 2027-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2023)
• Budget Amount: ¥21,060,000 (Direct Cost: ¥16,200,000、Indirect Cost: ¥4,860,000); Fiscal Year 2026: ¥3,120,000 (Direct Cost: ¥2,400,000、Indirect Cost: ¥720,000); Fiscal Year 2025: ¥6,890,000 (Direct Cost: ¥5,300,000、Indirect Cost: ¥1,590,000); Fiscal Year 2024: ¥6,890,000 (Direct Cost: ¥5,300,000、Indirect Cost: ¥1,590,000); Fiscal Year 2023: ¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000)
• Keywords: 根粒菌 / エフェクター / マメ科植物 / ダイズ / III型分泌系 / 共生 / クサネム / 根粒共生

Outline of Research at the Start

マメ科植物と根粒菌の根粒共生には、根粒菌が分泌するNod factor(NF)が必須であると長い間考えられてきた。しかし、申請者らとフランスのGiraud博士のグループは、ダイズ根粒菌のエフェクターBel2-5と、クサネム根粒菌のエフェクターErnAが、NFを介さずに根粒形成することを発見した。さらに、エフェクターによる根粒形成では、NFを介する根粒形成にみられる根毛感染は認められず、進化的に古い感染が観察されている。本研究では、根粒菌エフェクターとその共生シグナル活性化機構を解析することで、エフェクターによる根粒共生の分子基盤を解明し、根粒共生の起源を探る。

Outline of Annual Research Achievements

1. 根粒形成エフェクターの網羅的スクリーニング・・・共同研究者であるフランスのGiraud博士の研究室が所有する世界各地の多様なマメ科植物から単離された根粒菌30株ほどについてダイズnfr変異体に接種し、根粒形成する株をスクリーニングした。その結果、Bradyrhizobium属の根粒菌1株がダイズnfr変異体に根粒形成することを発見した。Giraud博士らによるゲノム解析により、この根粒菌株には既知の根粒形成エフェクターBel2-5、ErnAどちらも存在しないことが明らかになっており、この根粒菌が新規エフェクターを保持している可能性が示唆された。
2. ダイズ根粒菌/クサネム根粒菌エフェクターの共通性/差異性の解析・・・Bel2-5とErnAはダイズとクサネムにそれぞれ根粒形成を誘導するが相同性は低い。それぞれのエフェクターが宿主特異的に根粒形成誘導するのか、もしくは交換可能なのかを調べるために、エフェクターを入れ替えた根粒菌変異株を作成して根粒形成試験を行った。その結果、Bel2-5はクサネムに未発達の根粒を誘導することが判明した。一方、ErnAはダイズに根粒形成を誘導しなかったことから、それぞれのエフェクターは宿主特異的に機能する可能性が示唆された。
3. エフェクター発現植物の根粒形成誘導・・・それぞれのエフェクターが異種宿主において根粒形成を誘導するかを検証するため、ダイズ根においてエフェクターを発現する形質転換毛状根を作出し、その根粒形成能を検討した。クサネムにおいては、Giraud博士らによる研究でエフェクターErnAを発現させることにより、根に皮層細胞分裂と根粒形成が誘導されることが明らかとなった。一方、ダイズにおいては、Bel2-5を発現させることにより、毛状根の発根と伸長が著しく抑制されることが見出され、今回の実験条件ではBel2-5による細胞分裂などへの悪影響が強く発現したことが示唆された。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

Giraud博士との共同研究により、nfr変異体ダイズに根粒を形成する根粒菌を新たに１株発見することができた。この根粒菌株はBel2-5を保持していないことが示唆されており、新規エフェクターを保持している可能性が高い。今後の解析により新規根粒形成エフェクターの発見にいたる可能性も高いことから、順調に進展していると判断した。

Strategy for Future Research Activity

今回あたらしく発見したnfr変異ダイズに根粒形成する株については、Giraud博士と共同でエフェクター候補遺伝子の検、および遺伝子破壊株の作成を行い、nfr変異ダイズに接種することで根粒形成エフェクターであることを証明する。また、エフェクター遺伝子を発現する形質転換植物の作成については、クサネムとエフェクターErnAでは根に皮層細胞分裂と根粒形成が誘導されることが示されたが、ダイズにおいては、Bel2-5を発現させることにより、毛状根の発根と伸長が著しく抑制されることが明らかとなった。Bel2-5の発現に用いたユビキチンプロモーターが強すぎた可能性もあるため、今後は低発現プロモーターや誘導性プロモーターの利用も検討する。

Research Products

• [Int'l Joint Research] フランス農業開発研究国際協力センター(フランス)
• [Journal Article] Widespread <i>Bradyrhizobium</i> distribution of diverse Type III effectors that trigger legume nodulation in the absence of Nod factor (2023)
  • Author(s): Camuel, A., Teulet, A., Carcagno, M. Haq, F., Pacquit, V., Gully, D., Pervent, M., Chaintreuil, C., Fardoux, J., Horta-Araujo, N., Okazaki, S., Ratu, S., Gueye, F., Zilli, J., Nouwen, N., Arrighi, J.F., Luo, H., Mergaert, P., Deslandes, L., Giraud, E.
  • Journal Title: The ISME Journal Volume: 17 Issue: 9 Pages: 1416-1429
  • DOI: 10.1038/s41396-023-01458-1
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Presentation] Symbiotic roles of rhizobial type III effectors (2024)
  • Author(s): OKAZAKI SHIN
  • Organizer: The 6th Asian-Pacific Conference on Plant-Microbe Symbiosis and Nitrogen Fixation
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Unveiling a novel paradigm in Bradyrhizobium strains triggering NF- independent nodulation in soybean (2024)
  • Author(s): Safirah Tasa Nerves Ratu, Shogo Fukunaga, and Shin Okazaki
  • Organizer: The 6th Asian-Pacific Conference on Plant-Microbe Symbiosis and Nitrogen Fixation
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Nod-factor independent symbiotic phenomena and symbiotic inhibition factor of Bradyrhizobium and Aeschynomene genus (2024)
  • Author(s): Shogo Fukunaga, Shun Hashimoto, Shusei Sato, Shin Okazaki
  • Organizer: The 6th Asian-Pacific Conference on Plant-Microbe Symbiosis and Nitrogen Fixation
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Type three secretion system (T3SS) of Bradyrhizobium elkanii USDA61 restricts nitrogen-fixation efficiency in Lupinus spp. (2023)
  • Author(s): Safirah Tasa Nerves Ratu, Lidia Amelia, Shin Okazaki
  • Organizer: The 36th Conference of the Japan Society for Microbial Ecology and the 13th Asian Symposium on Microbial Ecology
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Nod-factor independent symbiotic phenomena and symbiotic inhibition factor of Bradyrhizobium and Aeschynomene genus (2023)
  • Author(s): Shogo Fukunaga, Shun Hashimoto, Shusei Sato, Shin Okazaki
  • Organizer: The 36th Conference of the Japan Society for Microbial Ecology and the 13th Asian Symposium on Microbial Ecology
  • Int'l Joint Research