| Budget Amount *help |
¥5,590,000 (Direct Cost: ¥4,300,000、Indirect Cost: ¥1,290,000)
Fiscal Year 2014: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
Fiscal Year 2013: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
Fiscal Year 2012: ¥2,210,000 (Direct Cost: ¥1,700,000、Indirect Cost: ¥510,000)
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| Research Abstract |
本研究はドライ系(予測とウエット系(実験)の両方向から、RNAタンパク質複合体の活性型形成に分子シャペロンがどう関わるかを最小単位の機能ドメインレベルで突き詰めようとする斬新な試みである。
先ずは、コンピューター・シミュレーションによるクライアント結合構造の探索手法の確立を目指して、分子動力学計算から求められた結合エネルギーとクライアントのAla置換部位との相関関係から結合インターフェース構造の推定が可能かどうかを検討した。具体的には、p21(cyclin-dependent kinase inhibitor)のAla置換による結合活性の変化からHuman PCNA(proliferating cell nuclear antigen)とp21の結台構造を特定しようと試みた実験(Nakanishi, M, et al.,J., Biol. Chem. 270 : 17060, 1995)を参照し、水溶媒中でのPCNAとp21(Ala置換したものも含めて)の結合エネルギーをMM-PBSA(Molecular Mechanic/Poisson-Boltzmann Surface Area)法及びMM-GBSA(MM/Generaｌized Born)法を用いて見積った。上記の2つの方法で見積られたAla置換による結合エネルギーの変化の傾向はほぼ一致したが、結合活性に関する実験結果を再現しなかった。また、推定誤差の範囲も大きかった。問題点として、設定したシミュレーション時間が小さかった点が挙げられる(今回はテストケースとして2ns)。更に長時間シミュレーション(20ns以上の)を可能とするため、GPUによる計算システムの構築が必要となる。
次に、RNAタンパク質複合体と分子シャペロンに関しての詳細な結合情報を得るために、クライアントであるRNA結合タンパク質Agoと分子シャペロンであるHsp90、コシャペロンであるHop及びp23に関して欠失体作製を行ない、お互いの欠失体間の結合性を評価することによって、それぞれのタンパク質が持つ特異的な相互作用ドメインを明らかにすることができる。以上のような戦略から、AgoのN末側からとC末側からの欠失体の作製を検討した。AgoはN末ドメイン、L1ドメイン、PMドメイン、L2ドメイン、Midドメイン、PIWIドメインの6つから成る。発現系としてはCMVプロモータープラスミドを使用し、宿主系としてはHeLa細胞を用いた。結果として、N末ドメインを持つC末側からの欠失体は細胞内で安定に蓄積されたが、その逆のC末ドメインを持つN末側からの欠失体は、L2-Mid-PIWIドメイン以外では、大変不安定で蓄積されなかった。以上を総合すると、各種の機能ドメインの発現にはN末ドメインとの融合が有利であるように思われた。よって、更なるドメイン別の発現ではこのアイデアを用いることとしたい。今後更に、Agoの欠失体の場合と同様に、Hsp90やコシャペロン(Hop及びp23)の欠失体の作製について検討する必要がある。
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