System for bovine blastocyst production from lyophilized sperm and diploid cells

• Project/Area Number: 24580407
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Section: 一般
• Research Field: Applied animal science
• Research Institution: Shinshu University
• Principal Investigator: HOCHI Shinichi 信州大学, 学術研究院繊維学系, 教授 (10283243)
• Project Period (FY): 2012-04-01 – 2016-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2015)
• Budget Amount: ¥5,460,000 (Direct Cost: ¥4,200,000、Indirect Cost: ¥1,260,000); Fiscal Year 2015: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000); Fiscal Year 2014: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000); Fiscal Year 2013: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000); Fiscal Year 2012: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
• Keywords: 凍結乾燥 / コラプス / α-ヘモリジン / トレハロース / ROCK阻害剤 / ビタミンE / 体細胞クローン / ICSI / SCNT / ケーキ / ウシ精子 / Tg' / 含水率 / 胚盤胞発生率 / αヘモリジン / ウシ顆粒膜細胞 / ケーキコラプス / DNA損傷 / アルカリコメットアッセイ / クローン胚盤胞 / フリーズドライ

Outline of Final Research Achievements

The aim of this study was to establish blastocyst production system from freeze-dried (FD) sperm and diploid cells in the bovine species. Results obtained were: (1) Incorporation of trehalose using alpha-hemolysin mutant did not inhibit DNA damage in FD granulosa cells. (2) Incidence of FD cake collapse was related with the glass transition temperature of the maximally freeze-concentrated phase (Tg'), and trehalose in FD buffer contributed to increase the Tg' and to inhibit the cake collapse. (3) ROCK inhibitor or alpha-tocopherol supplemented to recovery culture medium could rescue metaphase-II oocytes after vitrification and warming. (4) Morphologically normal blastocysts derived from both FD spermatozoa (via intracytoplasmic sperm injection) and FD fibroblasts (via somatic cell nuclear transplantation) were successfully produced in vitro.

Research Products

• [Int'l Joint Research] National Institute of Animal Science(韓国)
• [Journal Article] Multiple aster formation is frequently observed in bovine oocytes retrieved from 1 day-stored ovaries (2016)
  • Author(s): H. Hara, M. Tagiri, M. Hirabayashi & S. Hochi
  • Journal Title: Zygote Volume: 24 Issue: 1 Pages: 115-120
  • DOI: 10.1017/s096719941400080x
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] HIgh incidence of polyspermic fertilization in bovine oocytes matured in vitro after cryotop vitrification (2016)
  • Author(s): I-S. Hwang, D-J. Kwon, G-S. Im, K. Tashima, S. Hochi & S. Hwang
  • Journal Title: Cryo Letters Volume: 37 Pages: 27-33
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] High revivability of vitrified-warmed bovine mature oocytes after recovery culture with α-tocopherol (2015)
  • Author(s): Yashiro I, Tagiri M, Ogawa H, Tashima K, Takashima S, Hara H, Hirabayashi M, Hochi S.
  • Journal Title: Reproduction Volume: 149 Issue: 4 Pages: 347-355
  • DOI: 10.1530/rep-14-0594
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Microtubule assembly and in vitro development of bovine oocytes with increased intracellular glutathione level prior to vitrification and in vitro fertilization (2014)
  • Author(s): Hara H, Yamane I, Noto I, Kagawa N, Kuwayama M, Hirabayashi M, Hochi S.
  • Journal Title: Zygote Volume: 22 Issue: 4 Pages: 476-482
  • DOI: 10.1017/s0967199413000105
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Adverse effect of cake collapse on the functional integrity of freeze-dried bull spermatozoa (2014)
  • Author(s): Hara H, Tagiri M, Hwang IS, Takahashi M, Hirabayashi M, Hochi S.
  • Journal Title: Cryobiology Volume: 68 Issue: 3 Pages: 354-360
  • DOI: 10.1016/j.cryobiol.2014.04.005
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Rescue of vitrified-warmed bovine oocytes with Rho-associated coiled-coil kinase inhibitor. (2013)
  • Author(s): Hwang IS, Hara H, Chung HJ, Hirabayashi M, Hochi S.
  • Journal Title: Biology of Reproduction Volume: VOL.89 Issue: 2 Pages: 26-26
  • DOI: 10.1095/biolreprod.113.109769
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] High incidence of multiple aster formation in vitrified-warmed bovine oocytes after in vitro fertilization (2012)
  • Author(s): Hiromasa Hara
  • Journal Title: Theriogenology Volume: 77 Issue: 5 Pages: 908-915
  • DOI: 10.1016/j.theriogenology.2011.09.018
  • Peer Reviewed
• [Presentation] 卵丘細胞層ダウンサイズ後にガラス化保存した卵核胞期ウシ卵母細胞の蘇生能力 (2016)
  • Author(s): 田島 和弥, 山中 貴寛, 佐藤 美月, 平林 真澄 & 保地 眞一.
  • Organizer: 日本卵子学会
  • Place of Presentation: 朱鷺メッセ（新潟県新潟市）
  • Year and Date: 2016-05-14
• [Presentation] GV期ウシ卵丘卵母細胞複合体の裸化処理が胚盤胞の体外作出に及ぼす影響 (2015)
  • Author(s): 田島 和弥, 平林 真澄 & 保地 眞一.
  • Organizer: 日本繁殖生物学会
  • Place of Presentation: 宮崎大学（宮崎県宮崎市）
  • Year and Date: 2015-09-17
• [Presentation] ウシの精子保存技術のこれまでとこれから (2015)
  • Author(s): 保地 眞一.
  • Organizer: 日本繁殖生物学会 市民公開講座「宇宙における動物繁殖の可能性」
  • Place of Presentation: 宮崎市民プラザ（宮崎県宮崎市）
  • Year and Date: 2015-09-17
  • Invited
• [Presentation] ガラス化ウシ成熟卵母細胞の体外受精後に活性化補填することで胚盤胞発生率は改善できるか? (2015)
  • Author(s): 田切 美穂, 八代 育子, 平林 真澄 & 保地 眞一.
  • Organizer: 日本畜産学会
  • Place of Presentation: 宇都宮大学（栃木県宇都宮市）
  • Year and Date: 2015-03-28 – 2015-03-30
• [Presentation] α-トコフェロール存在下におけるガラス化・加温したウシ成熟卵母細胞の回復培養 (2014)
  • Author(s): 八代 育子, 平林 真澄 & 保地 眞一.
  • Organizer: 日本繁殖生物学会
  • Place of Presentation: 帯広畜産大学（北海道帯広市）
  • Year and Date: 2014-08-21 – 2014-08-24
• [Presentation] 保存卵巣由来のウシ前核期卵における星状体形成と胚盤胞発生との関係 (2014)
  • Author(s): 原 弘真, 田切 美穂, 平林 真澄 & 保地 眞一
  • Organizer: 日本繁殖生物学会
  • Place of Presentation: 帯広畜産大学（北海道帯広市）
  • Year and Date: 2014-08-21 – 2014-08-24
• [Presentation] 保存卵巣由来のウシ前核期卵における星状体形成ならびにその後の胚盤胞発生に及ぼす短期ROCK阻害処理の影響 (2014)
  • Author(s): 田切 美穂, 原 弘真, 黄 仁偰, 八代 育子, 平林 真澄 & 保地 眞一.
  • Organizer: 日本卵子学会
  • Place of Presentation: 神戸国際会議場（兵庫県神戸市）
  • Year and Date: 2014-05-16 – 2014-05-18
• [Presentation] ガラス化ウシ成熟卵母細胞の回復培養液におけるビタミンC及びEの添加効果 (2014)
  • Author(s): 八代 育子, 田切 美穂, 能登 一葉, 山根 伊織, 原 弘真, 保地 眞一.
  • Organizer: 第118回日本畜産学会
  • Place of Presentation: つくば
• [Presentation] 黄色ブドウ球菌由来αヘモリジン変異体を用いてトレハロース導入したウシ顆粒膜細胞の凍結乾燥耐性 (2014)
  • Author(s): 能登 一葉, 小林 あゆみ, 田切 美穂, 野村 隆臣, 保地 眞一.
  • Organizer: 第118回日本畜産学会
  • Place of Presentation: つくば
• [Presentation] Effect of cake collapse on integrity of freeze-dried bull spermatozo (2014)
  • Author(s): H. Hara, M. Tagiri, M. Hirabayashi, S. Hochi.
  • Organizer: 第40回国際胚移植学会 (IETS)
  • Place of Presentation: レノ/ネバダ・USA
• [Presentation] Production of bovine blastocysts by nuclear transfer using freeze-dried fibroblast cells (2013)
  • Author(s): K. Matsukawa, N. Kori, S. Hochi, S. Akagi, K. Edashige, M. Kasai, P. Loi.
  • Organizer: 第46回北米生殖生物学会 (SSR)
  • Place of Presentation: ケベック/モントリオール・カナダ
• [Presentation] 成熟培養におけるROCK阻害が保存卵巣に由来するウシ卵母細胞の発生能に及ぼす影響 (2013)
  • Author(s): 山根 伊織, 原 弘真, 平林 真澄, 保地 眞一.
  • Organizer: 第117回日本畜産学会
  • Place of Presentation: 新潟
• [Presentation] ウシ繊維芽細胞の培養時期が細胞周期および凍結乾燥後のDNA損傷に与える影響 (2013)
  • Author(s): 郡 七海, 枝重 圭祐, 葛西 孫三郎, 赤木 悟史, 保地 眞一, 松川 和嗣.
  • Organizer: 第117回日本畜産学会
  • Place of Presentation: 新潟
• [Presentation] Rescue of vitrified-warmed bovine oocytes by recovery culture in the presence of Rho-associated coiled-coil kinase (ROCK) inhibitor (2013)
  • Author(s): 黄 仁偰, 八代 育子, 原 弘真, 平林 真澄, 保地 眞一.
  • Organizer: 第106回日本繁殖生物学会
  • Place of Presentation: 府中
• [Presentation] 凍結乾燥ウシ精子の発生能に及ぼすコラプスの影響 (2013)
  • Author(s): 原 弘真, 田切 美穂, 平林 真澄, 保地 眞一.
  • Organizer: 第106回日本繁殖生物学会
  • Place of Presentation: 府中
• [Presentation] 凍結乾燥ケーキにおけるコラプス形成と復水ウシ精子の正常性との関係 (2013)
  • Author(s): 原 弘真
  • Organizer: 日本畜産学会第116回大会
  • Place of Presentation: 広島市
• [Presentation] ガラス化したウシ成熟卵母細胞の蘇生率は回復培養液へ添加したROCK阻害剤によって改善される (2013)
  • Author(s): 八代 育子
  • Organizer: 日本畜産学会第116回大会
  • Place of Presentation: 広島市
• [Presentation] 予備凍結および保存温度が凍結乾燥ウシ体細胞のDNA損傷および核移植後の発生に及ぼす影響 (2012)
  • Author(s): 西本 あずさ
  • Organizer: 日本繁殖生物学会第105回大会
  • Place of Presentation: つくば市
• [Presentation] ガラス化・加温したウシ体外成熟卵子における細胞内グルタチオン濃度と精子星状体形成および胚盤胞発生との関係 (2012)
  • Author(s): 原 弘真
  • Organizer: 日本繁殖生物学会第105回大会
  • Place of Presentation: つくば市
• [Remarks] 生殖工学研究室
  • URL: http://fiber.shinshu-u.ac.jp/hochi/index.html