成育医療における骨・靱帯の生分解性足場材料の探索と融合蛋白質の創製

• Project/Area Number: 24659506
• Research Category: Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: Pediatrics
• Research Institution: National Research Institute for Child Health and Development
• Principal Investigator: 川北 敦夫 独立行政法人国立成育医療研究センター, その他部局等, 研究員 (40338083)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 梅澤 明弘 独立行政法人国立成育医療研究センター, その他部局等, その他 (70213486)
• Project Period (FY): 2012-04-01 – 2014-03-31
• Project Status: Discontinued (Fiscal Year 2012)
• Budget Amount: ¥3,900,000 (Direct Cost: ¥3,000,000、Indirect Cost: ¥900,000); Fiscal Year 2014: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000); Fiscal Year 2013: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000); Fiscal Year 2012: ¥780,000 (Direct Cost: ¥600,000、Indirect Cost: ¥180,000)
• Keywords: キメラタンパク質 / 細胞足場 / BMP4 / 骨形成

Research Abstract

我々は細胞外マトリックスの代表的な細胞接着タンパクであるファイブロネクチンの持つコラーゲンへの高い結合性に注目した。本研究の目的は骨形成タンパクの一つであるBone morphogenic protein 4( BMP-4 )にファイブロネクチンのコラーゲン結合領域を融合させたキメラタンパクを作製し、コラーゲン複合化合成高分子担体へ結合させることで培養担体の持つ利点を生かしたまま、成長因子の供給も行うことのできるインテリジェント再生足場材料を開発することである。I. コラーゲン複合化合成高分子シートの作製として、生体吸収性合成高分子であるポリグリコール酸-ポリ乳酸共重合体(PLGA)からなるニットメッシュにアテロ化コラーゲンのマイクロスポンジを真空凍結乾燥法にて複合化させグルタールアルデヒド架橋を行った。メッシュの空隙をコラーゲンの網目で覆うことで細胞に対する親和性と表面積の増大を図った。キメラタンパクの作製として、ヒト正常細胞に発現するファイブロネクチンのmRNAを鋳型として増幅させた相捕的DNA遺伝子配列の中から既知であるコラーゲン結合領域の遺伝子配列（約1000塩基）を酵素処理にて切り出しを行った。同様に正常ヒト胎盤由来mRNAを鋳型として骨形成タンパク BMP-4の成熟型遺伝子配列（約400塩基）を抽出し、両者を連結したタンパク発現ベクターを作製した。また、シート上のキメラタンパク局在を生体外にて免疫組織学的に評価するとともに培養液中へのタンパク放出程度をファイブロネクチンの継時的なELISA法により推定した。キメラ化BMP-4の機能確認は培養未分化骨髄間質細胞へのキメラタンパクの添加および複合化シートへの細胞播種実験により、骨分化マーカー遺伝子の発現、alkaline phosphatase活性を測定した。