糖鎖量子ドットを用いた蛍光イメージング法によるゴルジ体酵素の１分子キネティクス

Research Project

Project/Area Number	24710241
Research Category	Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
Allocation Type	Multi-year Fund
Research Field	Living organism molecular science
Research Institution	Hokkaido University
Principal Investigator	長堀紀子北海道大学, 先端生命科学研究科(研究院), 特任助教 (90372268)
Project Period (FY)	2012-04-01 – 2013-03-31
Project Status	Discontinued (Fiscal Year 2012)
Budget Amount *help	¥4,680,000 (Direct Cost: ¥3,600,000、Indirect Cost: ¥1,080,000) Fiscal Year 2013: ¥2,340,000 (Direct Cost: ¥1,800,000、Indirect Cost: ¥540,000) Fiscal Year 2012: ¥2,340,000 (Direct Cost: ¥1,800,000、Indirect Cost: ¥540,000)
Keywords	糖転移酵素 / 1分子イメージング / 量子ドット / ゴルジ体 / 全反射蛍光顕微鏡 / Glyconanoparticle
Research Abstract	糖脂質合成を担うシアル酸転移酵素である SiaT1 は、ゴルジ膜上で GalT1 および Sia2とヘテロダイマーを形成することが知られている。この3種類の糖転移酵素について異なる蛍光タンパク質でラベル化し、1分子蛍光顕微鏡を用いた解析行うことで、GalT(モノマー)、GalT1(ホモ)、 GalT1-SiaT(ヘテロ)、SiaT1(モノマー)、SiaT1(ホモ)、SiaT1-SiaT2(ヘテロ)、SiaT2(モノマー)、 SiaT2(ホモ)について、それぞれの酵素複合体を1分子ずつ(複合体をひとつずつ)区別して解析することを目的として実験を開始した。 <糖鎖量子ドット作製方法の改良> 糖鎖量子ドットより簡単に作製できるように、作製手順･方法についての条件検討を行った。 <蛍光ラベルした糖転移酵素遺伝子の作製> WT-MEFおよびSiaT1-KO MEFについて、その糖脂質および糖タンパク質発現プロファイル解析を行ったところ、WT-MEFではいずれの標的糖転移酵素も発現していることが支持された。SiaT1は糖脂質を基質として作用し、糖タンパク質（N-グリカン）には反応しないにもかかわらず、糖タンパク質糖鎖プロファイルに顕著な変化が観察された。この糖鎖解析方法および観察された現象については、論文として報告済みである。次に、WT MEFよりmRNAを抽出し、逆転写反応によって得られたDNA混合物をテンプレートして、各標的糖転移酵素に対応するプライマーを用いてPCR反応を行い、各糖転移酵素遺伝子のクローニングを行った。反応条件検討およびシーケンス確認の結果、３種の標的遺伝子のうち、SiaT1,SiaT2については正しい配列の遺伝子を得られた。現在GalTについての反応条件の最適化およびシーケンス確認を行うと共に、蛍光タンパク質との融合タンパク質を生成するための遺伝子を作製中である。