| Project/Area Number |
24H00467
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (A)
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Medium-sized Section 34:Inorganic/coordination chemistry, analytical chemistry, and related fields
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| Research Institution | Kitakyushu National College of Technology (2025)
Kyushu University (2024) |
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Principal Investigator |
片山 佳樹 北九州工業高等専門学校, 未登録, 校長 (70284528)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
馬場 英司 九州大学, 医学研究院, 教授 (00315475)
森 健 九州大学, 工学研究院, 准教授 (70335785)
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| Project Period (FY) |
2024-04-01 – 2027-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2025)
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| Budget Amount *help |
¥46,020,000 (Direct Cost: ¥35,400,000、Indirect Cost: ¥10,620,000)
Fiscal Year 2025: ¥13,520,000 (Direct Cost: ¥10,400,000、Indirect Cost: ¥3,120,000)
Fiscal Year 2024: ¥19,890,000 (Direct Cost: ¥15,300,000、Indirect Cost: ¥4,590,000)
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| Keywords | がん診断 / ELISA / 酵素 / 細胞診断 / 細胞膜抗原 / 蛍光抗体法 / フローサイトメトリー / コンパニオン診断 / 蛍光分子プローブ / 酵素増感法 / がん |
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| Outline of Research at the Start |
がん治療においては、個々のがんに有効な制癌剤を個人レベルで特定するコンパニオン診断が極めて重要である。しかし、現在、まだ有効な方法がない。細胞膜抗原は、細胞の性質を直接反映しており、これらを同定することは、コンパニオン診断の最も有効な手法である。ただ、診断に重要な膜たんぱく質の大半は発現量が低く、細胞や組織を用いる従来の手法では検出できない。本研究では、これまでに開発した新規な分子プローブシステム(CLAMP法）に、独自に探索したヒトに存在しない酵素(直交性酵素）を適用することで、多種類の膜抗原同時検出のためのCLAMP法を確立して実用的ながんコンパニオン診断(HOE-QS)を実現する。
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、ヒト細胞に存在しないヒト直交性酵素を開発して、申請者らが提唱する増感システムであるCLAMP法に適用し、細胞に存在する特異抗原を超高感度に検出できるシステムを開発すること、およびそれをがんコンパニオン診断に適用することを目的としている。
初年度は、ラムノシダーゼを用いて、新たに開発に成功したCLAMP法用の青色蛍光プローブと組み合わせて、その感度を検討した。高感度かは達成できたが、一方で、酵素の非特異吸着がみられてバックグラウンドが上がる現象が確認された。この原因を探ったところ、酵素を抗体に標識する際に用いるビオチン-ストレプトアビジンが多対多の大きな複合体を形成することによることを明らかとした。さらに、これを解決するために、過剰のビオチンを添加する手法を確立して、バックグラウンドの問題を解決した。次いで更なる高感度化を指向して、由来の異なるラムノシダーゼを探索し、新規なラムノシダーゼを発見した。本酵素を用いて、CLAMP法によりCD44の検出を検討したところ、従来法に比べて格段の高感度化に成功した。また、細胞を固定化処理して細胞膜透過性を上げてやることで、更なる増感が可能であることも見出した。周辺細胞への蛍光の漏れ込みに関しては、phの制御によりキノンメチドの分解までの拡散距離を制御できることを新たに見出し、制御できるようになった。
また、キシロシダーゼに関しては、新たに緑色のCLAMP基質の合成に成功した。ただ、こちらを適用したところ、従来見出していたキシロシダーゼではバックグラウンドが高いことがわかったので、新たに由来の異なるキシロシダーゼを探索し、活性が高く非特異吸着の低減できるものを見出した。これにより、緑色基質でも高感度な検出が可能となった。そこで、すでに開発していた青色CLAMP基質との併用で２種の抗原同時検出を試み成功した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
当初計画していたヒト細胞直交性酵素を用いるCLAMP法での検討において、予測していなかった種々の問題が発生したが、いずれもその原因の解明に成功し、それを克服できた。また、新たに、従来よりも格段に優れた性能のヒト直交性酵素の探索にも成功して、従来の蛍光抗体法で最も高感度な手法よりも高感度な検出を実現できている。さらには、２色のCLAMP基質の開発にも成功して、従来の酵素抗体法では不可能であった、同一条件での多食同時検出にも成功して、コンパニオン診断へ大きく前進できた。以上の理由により、計画以上の進展と評価した。
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| Strategy for Future Research Activity |
今回見出した新規なキシロシダーゼとラムノシダーゼは、非常に優れた性能を有するので、すでに見出しているアラビノフラノシダーゼと組み合わせての３色同時検出を検討して、より実用的な診断法の基礎を確立する。また、そのために赤色基質の開発を急ぐ。今回、基質の化学構造によっては、細胞膜透過が悪く、その克服として、標的抗原を細胞内まで拡充し、細胞固定化を併用した診断システムへと展開する。また、基質の設計においては、酵素反応による派生するキノンメチドの反応性をさらに上げることで、拡散距離を短くして、隣接細胞への蛍光シグナルの漏れ込みを防ぐ必要も出てきたので、分子に電子吸引基を導入した分子の検討を行う。
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