Identification of cytoplasmic triggers of autoimmunity in interspecific Capsicum hybrids

• Project/Area Number: 24K01753
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 39030:Horticultural science-related
• Research Institution: Kindai University
• Principal Investigator: 細川 宗孝 近畿大学, 農学部, 教授 (40301246)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 田中 義行 京都大学, 農学研究科, 教授 (20704480) ; 白澤 健太 公益財団法人かずさDNA研究所, 先端研究開発部, 室長 (60527026)
• Project Period (FY): 2024-04-01 – 2027-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2024)
• Budget Amount: ¥18,590,000 (Direct Cost: ¥14,300,000、Indirect Cost: ¥4,290,000); Fiscal Year 2026: ¥4,680,000 (Direct Cost: ¥3,600,000、Indirect Cost: ¥1,080,000); Fiscal Year 2025: ¥5,590,000 (Direct Cost: ¥4,300,000、Indirect Cost: ¥1,290,000); Fiscal Year 2024: ¥8,320,000 (Direct Cost: ¥6,400,000、Indirect Cost: ¥1,920,000)
• Keywords: トウガラシ / 細胞質 / 交雑不和合性 / エピスタシス / ミトコンドリア / 座止

Outline of Research at the Start

本研究ではNLRが関わる生殖隔離に細胞質がどのように関与するのかという新しい視点を持つ。細胞質は雄性不稔を引き起こすため農業上貴重な遺伝資源であるといえる。ミトコンドリアのゲノム編集は本研究でも行う予定であるが、本研究を出発として、耐病性の誘発、生殖隔離の誘導など細胞質の利用につながるのではないかと考えている。本研究の目的は以下の通りである。以下の４つを３年間で行うことで目的を達成させる。１．B遺伝子のエピスタシスパートナーであるA遺伝子の特定　２．細胞質因子と相互作用する核側の自己免疫誘導因子の特定　３．細胞質側の自己免疫誘導因子の特定　４．ゲノム編集によるミトコンドリア遺伝子のノックアウト

Outline of Annual Research Achievements

Capsicum chinense ‘チャラピタ’ (2n = 24)のゲノム解読に取り組んだ。‘チャラピタ’のショートリード配列データを利用したkmer解析から、‘チャラピタ’のゲノムサイズは約3.2 Gbであることが推定された。続いて‘チャラピタ’の葉から高分子DNAを抽出し、PacBio社のシークエンサーRevioのロングリード技術を使用してHiFi配列データを取得した。配列データは品質で精査した後にアセンブルを行い、コンティグ配列を得た。さらにBioNano GenomicsのSaphyrの光学ゲノムマッピング技術を使用してコンティグ配列を連結しスキャフォルド配列を得た。長さが100 Mbを超えるスキャフォルド配列は14本あり、その総延長は3.0 Gbだった。
B遺伝子のエピスタシスパートナーであるA遺伝子の特定に向けて、‘チャラピタ’（AAbb）の花に対して、変異源処理（EMSおよびイオンビーム処理）を行い、花粉(A遺伝子が変異して、花粉の遺伝子型がabとなることを期待)を‘タカノツメ’(aaBB)に交配し、播種して正常な生育を示す株(aaBb)をスクリーニングすることを試みた。
‘チャラピタ’の花に対して、ArおよびCイオンビームを25, 50, 150Gyの強度で照射し、花粉を‘タカノツメ’に交雑した。‘タカノツメ’の花100程度交雑し、8果実を得たが、いずれもしいなであり、交雑種子を得ることはできなかった。また、EMSを揮発させた容器内に‘チャラピタ’花を1晩静置し、花粉を‘タカノツメ’の花100程度に交雑し、36果実を得たが、いずれも果実の肥大が悪く、こちらでも交雑種子を得ることはできなかった。変異源処理中に花粉の発芽能が失われるため、花粉への変異源処理は難しいと考えられた。
C. chineneの細胞質に反応して座止化させるC. annuumの核側因子を特定するための分離集団作成のための親系統の育成が完了した。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

イオンビーム照射によって花粉を生存させることが難しく、実験がうまく行っていない。戦略を変えて実験を開始したため、若干の遅れが生じている。なお、GWAS解析のための交雑実生集団の準備は順調に進んでいる。

Strategy for Future Research Activity

ddRAD-Seq解析により取得したSNPの連鎖解析から‘チャラピタ’の遺伝地図を構築する。これに14本のスキャフォルド配列を整列化し、‘チャラピタ’の染色体配列を作成する。トランスクリプトーム配列データ等を利用して、遺伝子予測を完了する。
‘チャラピタ’種子にイオンビームを処理したM1種子を得ている。花粉への変異源処理の代替として、‘チャラピタ’種子に変異源M1を栽培し、花粉を‘タカノツメ’に交雑することで、播種して正常な生育を示す株(aaBb)をスクリーングすることが考えられる。
細胞質に反応する核側因子特定のために、分離集団を作成しddRAD-seqを行う予定である。少なくとも候補遺伝子の到達には進みたいと考える。