| Project/Area Number |
24K01823
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 40020:Wood science-related
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| Research Institution | Shizuoka University |
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Principal Investigator |
河合 真吾 静岡大学, 農学部, 教授 (70192549)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
米田 夕子 静岡大学, 農学部, 准教授 (90638595)
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| Project Period (FY) |
2024-04-01 – 2027-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2024)
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| Budget Amount *help |
¥18,330,000 (Direct Cost: ¥14,100,000、Indirect Cost: ¥4,230,000)
Fiscal Year 2026: ¥4,940,000 (Direct Cost: ¥3,800,000、Indirect Cost: ¥1,140,000)
Fiscal Year 2025: ¥4,290,000 (Direct Cost: ¥3,300,000、Indirect Cost: ¥990,000)
Fiscal Year 2024: ¥9,100,000 (Direct Cost: ¥7,000,000、Indirect Cost: ¥2,100,000)
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| Keywords | アクチノリザル共生 / 根粒共生関連遺伝子 / 生合成遺伝子発現挙動 / 環状ジアリールヘプタノイド / 根毛変形因子 |
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| Outline of Research at the Start |
申請者らは「アクチノリザル樹木とフランキアの共生に関わるシグナル化合物である環状ジアリールヘプタノイド（CDH)を「有機化学的に単離する」「生合成遺伝子を探す」ことで本共生機構の解明を行ってきた。
本研究では、CDHがアクチノリザル樹木とフランキアの相利共生に関わることを明確にするため、CDHの生合成関連遺伝子類の発現挙動を植物部位・栽培環境、時間軸等の要因を加えて明らかにすることとした。さらには、ゲノム編集を駆使してCDH生合成遺伝子欠損植物体を作成し、根粒共生現象の表現型である根粒数の変化を比較することで重要遺伝子を特定することとした。
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| Outline of Annual Research Achievements |
アクチノリザル樹木であるオオバヤシャブシと放線菌フランキアとの根粒共生のシグナル物質として特定できた環状ジアリールヘプタノイド（CDH）生合成遺伝子のうち、今年度は、４-クマル酸CoAリガーゼ（４CL)について検討を行った。その結果、組換えタンパク質のin vitroでの反応解析が終了し、本酵素遺伝子がCDHを含む樹木二次代謝産物の生合成に関わることが明らかとなった。しかしながら、ジケチド型骨格にマロニルCoAを縮合する酵素の検索および反応系の検討をおこなったが、その反応を触媒する酵素系や反応条件をを見出すことはできなかった。
現在、これまでに取得できたPKS Ⅲ遺伝子について、リアルタイムPCRによる発現量解析のためのプライマーやプローブの設計・調製と予備実験が終了し、現在、オオバヤシャブシ実生の部位（葉、根）ならびに栽培培地条件（特に窒素濃度）による発現量解析に取りかかっている。
一方、マメ科と根粒菌の根粒共生の制御因子として知られるNIN遺伝子が、アクチノリザル樹木にも存在することを証明する目的で、オオバヤシャブシcDNAに対し、NIN遺伝子の全長遺伝子配列を取得し、が決定できた。
また、同じアクチノリザル共生を行う樹木であるヤチヤナギ若枝を入手し、次世代シーケンス解析を行った、その結果、確認できたPKS Ⅲ型の遺伝子は２種のみで、前述のオオバヤシャブシ同様、ジケチド型骨格にマロニルCoAを縮合する酵素あるいは反応系を確認することはできなかった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
リアルタイムPCRによる遺伝子発現の解析が若干遅れているが、これはプローブの設計に時間を要したためであるが、現在各種植物体による予備解析をおこなっている。根粒共生に係るNIN遺伝子については、オオバヤシャブシの各組織から得たRNA-seq解析データの組み合わせから存在を確認し、推定配列から構築したプライマーを用いたPCR等により全長NIN配列を導入したプラスミドを構築することができた。今後はNIN遺伝子に関してもリアルタイムPCRに必要なプライマー及びプローブの設計が可能となった。
さらに、予定にはなかったヤチヤナギ若枝試料を入手できたことから、このRNAのシーケンス解析によって2種のPKSⅢ遺伝子を取得できた。これらPKSⅢを既報に従って大腸菌に導入し、反応解析を行ったところ、1種がジケチドCoA生合成酵素遺伝子、他種がフラボノイド前駆体であるカルコン生合成遺伝子であることが判明し、ジアリールヘプタノイド生合成に係る遺伝子は1種である可能性が示唆され、今後反応系を精査する必要があると結論している。
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| Strategy for Future Research Activity |
リアルタイムPCRによる遺伝子発現の解析に関しては、目的とするCDH生合成酵素遺伝子のうちPKSⅢ型Ⅲ種の遺伝子のプローブの設計が終了しており、現在オオバヤシャブシ植物体の窒素添加の有無による発現量について予備解析をおこなっている。今後は、植物体へのフランキア添加の有無による発現量の解析を予定している。一方、根粒共生に係るNIN遺伝子については、リアルタイムPCRに必要なプライマー及びプローブの設計を早急に行い、上述の植物体での発現量を調査する。こちらの遺伝子に関しては、根での高い発現が予想されているため、部位別の調査も課題に加えている。
さらに、ヤチヤナギPKSⅢの反応解析の結果、1種がジケチドCoA生合成酵素遺伝子、他種がフラボノイド前駆体であるカルコン生合成遺伝子であることが判明した。この事実は、オオバヤシャブシのPKSⅢ遺伝子の反応解析結果と全く同じであり、ジアリールヘプタノイド生合成に係る遺伝子はこれら２種の樹木では、1種類である可能性が強く示唆された。したがって、当初予想したウコンで報告された２つの異なる酵素で段階的に反応が進行するというよりはむしろ、イネで報告された１種の酵素によって２段階反応が一気に進行するかのうせいがかんがえられた。このことから、今後酵素反応系（pH、反応時間、添加基質量等）を精査し、反応生成物の解析を進める予定である。
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