| Project/Area Number |
24K02014
|
|---|
| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
|
| Allocation Type | Multi-year Fund |
|---|
| Section | 一般 |
|---|
| Review Section |
Basic Section 43060:System genome science-related
|
|---|
| Research Institution | Kyoto University |
|---|
Principal Investigator |
佐久間 哲史 京都大学, 農学研究科, 特定教授 (90711143)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2024-04-01 – 2027-03-31
|
| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2024)
|
| Budget Amount *help |
¥18,460,000 (Direct Cost: ¥14,200,000、Indirect Cost: ¥4,260,000)
Fiscal Year 2026: ¥5,590,000 (Direct Cost: ¥4,300,000、Indirect Cost: ¥1,290,000)
Fiscal Year 2025: ¥5,980,000 (Direct Cost: ¥4,600,000、Indirect Cost: ¥1,380,000)
Fiscal Year 2024: ¥6,890,000 (Direct Cost: ¥5,300,000、Indirect Cost: ¥1,590,000)
|
|---|
| Keywords | ゲノム編集 / CRISPR-Cas |
|---|
| Outline of Research at the Start |
CRISPR-Cas9を基盤としたゲノム編集ツールは、単純なゲノムDNAの切断のみならず、塩基編集、プライム編集、フレーム編集、および転写の活性化や抑制など極めて多様な用途に利用されている。しかしながら、これらの高度に多様化したCas9依存的操作を包括的に同時かつ直交型で制御可能なシステムは確立されていない。本研究では、これらのCas9依存的操作から、任意の組み合わせで、標的配列（sgRNA）依存的に同時制御することを可能にする“CRISPR-bacflip”システムを開発する。
|
| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、ゲノムDNAの切断、塩基編集、プライム編集、フレーム編集、および転写の活性化や抑制など高度に多様化したCRISPR依存的操作を包括的に同時かつ直交型で制御可能なシステム“CRISPR-bacflip”を確立することを目的としている。2024年度は、その基盤となる要素技術の改良や同時制御の実証実験を実施した。
要素技術の改良の一例として、フレーム編集をCas12aによる長鎖欠失の制御に応用した技術の開発を実施した。フレーム編集技術の開発において使用されたT4 DNA polymerase（T4Pol）に加え、類縁の酵素であるRB69 DNA polymerase（RB69Pol）の効果を実証すると共に、T4Pol変異体やT4PolとRB69Polのドメインを入れ替えたキメラ酵素の機能性を検証し、従来の酵素とは異なる変異パターンを誘導可能な構造体を見出した。
同時制御の実証実験としては、転写の活性化と抑制、およびDNAの切断を同時制御可能なCRISPRaicシステムを利用した変異パターン制御を実証した。一例として、内在のPOLL遺伝子を活性化しつつ標的遺伝子座の切断を実施した場合、導入される変異パターンに占める1塩基挿入の割合が上昇することが示された。また、定量的RT-PCR解析により、同時制御時に誘導される内在遺伝子の転写の活性化や抑制が、理論通りの直交性を伴って実行されていることを明らかにした。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
「研究実績の概要」欄に記載したように、CRISPR-bacflipを構成する要素技術の改良に成功すると共に、複数の機能を統合したシステムの精密な動作性と意義を示すことができた。更に、当年度に実施した要素技術開発の結果から、研究計画段階で想定していたCas9依存的技術にとどまらず、Cas12aなどその他のCRISPRシステムにもCRISPR-bacflipの概念を適用できる可能性も示唆されているところである。これらの成果は、次年度以降に実施するCRISPR-bacflipの要素技術の更なる拡張・進化や、より複雑な組み合わせでの検証に直結するものであり、初年度の成果として十分な進展があったと判断できる。
|
| Strategy for Future Research Activity |
今後は、CRISPR-bacflipを構成する種々の技術のうち、base editorやprime editorなどの要素技術の最適化を行うと共に、その他の技術を含めた統合型システムの構築と更なる実証を実施していく計画である。現在では、様々に多様化・高度化したCRISPR依存的技術について、目的に応じて適切な技術を選択し、適材適所で使い分ける形で運用されるのが一般的である。しかしながら実際の細胞改変や個体改変においては、複数の目的が複雑に組み合わさるケースも少なくなく、高度に細分化された個々の技術を個別に利用して段階的に操作を加えていく煩雑性が課題となっている。CRISPR-bacflipの確立により、この問題を解決し、様々な細胞内操作の同時多発的な誘導を実現することを目指す。
|
