| Project/Area Number |
24K02044
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 44030:Plant molecular biology and physiology-related
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| Research Institution | Okayama University |
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Principal Investigator |
坂本 亘 岡山大学, 資源植物科学研究所, 教授 (20222002)
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| Project Period (FY) |
2024-04-01 – 2027-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2024)
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| Budget Amount *help |
¥18,590,000 (Direct Cost: ¥14,300,000、Indirect Cost: ¥4,290,000)
Fiscal Year 2026: ¥4,550,000 (Direct Cost: ¥3,500,000、Indirect Cost: ¥1,050,000)
Fiscal Year 2025: ¥4,940,000 (Direct Cost: ¥3,800,000、Indirect Cost: ¥1,140,000)
Fiscal Year 2024: ¥9,100,000 (Direct Cost: ¥7,000,000、Indirect Cost: ¥2,100,000)
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| Keywords | 光合成 / チラコイド膜リモデリング / 植物生理学 / タンパク質複合体 / ライブイメージング |
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| Outline of Research at the Start |
光合成エネルギー転換反応の足場となる葉緑体のチラコイド膜では、グラナとストロマラメラの基本構造が認知されているものの、それらの形成・維持を担う分子システムの理解は長らく謎であった。しかし、最近、チラコイド膜の変形や分裂・融合に関与する膜リモデリング分子が明らかになってきた。本研究ではこれらのチラコイド膜リモデリング分子に着目し、それらの生理作用を解明することで、チラコイド膜のホメオスタシス現象「チラコスタシス」の全貌を明らかにする。ライブイメージングを駆使してダイナミックなチラコスタシスの可視化を試み、これらの新たな知見を葉緑体分化の根本現象と位置付けた葉緑体生物学の再構築を目指す。
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、植物で光合成エネルギー転換反応の足場となる葉緑体のチラコイド膜が、膜リモデリングを介して維持される仕組みを広く「 チラコスタシス（ ＝チラコイド＋ホメオスタシス ） 」と定義し、これまでの申請者らの研究で明らかとなったチラコイド膜リモデリングの主要３分子,VIPP1, FZL, CURT1に着目し、膜形成・融合・湾曲・修復など、それぞれがチラコスタシスのどの要素で機能するかを明らかにする。今年度は以下の項目について研究を進めた。
（１）膜リモデリング分子の可視化：それぞれのタンパク質をGFPとの融合タンパク質として葉緑体内で発現させ、in vivoで可視化するための材料を整備した。これまでに構築したVIPP1-GFPに加え、VIPP1-CURT1A, FZL-GFPを発現したシロイヌナズナ個体、GFP以外にmCherryをタグに用いた個体の作成を進めた。VIPP1では膜ストレスに応答したダイナミックな会合・脱会合が観察されたので、同様の応答をFZLやCURT1が示すかどうかをライブイメージングで観察した。CURT1A-GFPはチラコイド膜の周縁に発現が観察されたが、ストレスに応答した明瞭なダイナミクスは観察されなかった。FZLについては安定した発現が観察される個体が作出されなかった。
（２）膜リモデリング分子との相互作用因子の解析：上で準備する材料を用いてGFP-trap解析を進め、相互作用が明らかとなったタンパク質の解析を進めた。今年度は、VIPP1と相互作用するタンパク質として葉緑体局在HSP70の重要性が示唆された。加えて、CURT1とGFP-trapでの解析を検討し、実験のための条件検討を行った。
（３）突然変異体の解析：チラコイド膜リモデリング分子機能の解析として、これまで致死変異のみが得られていたVIPP1について、エピアリルにより得られたVIPP1ノックダウン変異が得られている。この変異体は斑入り形質を示すことと、その安定性、VIPP1タンパク質蓄積量と、光合成活性について解析を行なった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
膜リモデリング分子の可視化に関しては順調に進んでいるが、これまでに作出したFZL-GFPではGFP蛍光が定常的に検出できなかった。今後、コンストラクトの作成から再検討して形質転換個体の作成を行う。CURT1A-GFPに関しては予想されたグラナ周辺部での局在が観察されたので、来年度以降VIPP1-mCherryと組み合わせた多重検出などを試みてチラコスタシスと膜リモデリング分子の関連性を解析する。
GFP-trapに関してVIPP1では免疫沈降と質量分析による候補タンパク質の同定が進んでおり、これらの詳細な解析を今後も継続する。CURT1Aについても予備実験が進んでいるので、免疫沈降と質量分析を今後試みる。FZLについてはGFPの発現を再検討する必要があるため、当面はVIPP1とCURT1Aに集中して研究を進める。
新たに得られたVIPP1ノックダウンについてはVIPP1蓄積量が予想通り50%程度に低下していることを確認したので、後代における斑入り形質の安定性とチラコイド膜構造の変化について電子顕微鏡観察を試みる。
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| Strategy for Future Research Activity |
本研究の中心課題である膜リモデリング分子の解析は順調にすすんでおり、今後も継続してこれらの解析を進めるが、FZL-GFPの発現が安定して検出されないため、当面はVIPP1とCURT1Aに絞り今後の解析を進める。免疫沈降により得られた相互作用タンパク質の解析はVIPP1で順調に進んでおり、CURT1Aでも質量分析で相互作用が検出されれば次年度以降に詳細な解析を行う。
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