| Project/Area Number |
24K02071
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 45010:Genetics-related
Basic Section 45020:Evolutionary biology-related
Sections That Are Subject to Joint Review: Basic Section45010:Genetics-related ,Basic Section45020:Evolutionary biology-related
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
熊坂 夏彦 東京大学, 医科学研究所, 教授 (80525527)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
福田 篤 東海大学, 医学部, 准教授 (00638091)
中林 一彦 国立研究開発法人国立成育医療研究センター, 周産期病態研究部, 室長 (10415557)
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| Project Period (FY) |
2024-04-01 – 2027-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2024)
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| Budget Amount *help |
¥18,590,000 (Direct Cost: ¥14,300,000、Indirect Cost: ¥4,290,000)
Fiscal Year 2026: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000)
Fiscal Year 2025: ¥11,310,000 (Direct Cost: ¥8,700,000、Indirect Cost: ¥2,610,000)
Fiscal Year 2024: ¥6,110,000 (Direct Cost: ¥4,700,000、Indirect Cost: ¥1,410,000)
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| Keywords | CRISPR転写制御 / ヒト幹細胞 / ガウス過程 / オルガノイド / ゲノムワイド関連解析 / 統合失調症 / シングルセル解析 / 抑制神経 |
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| Outline of Research at the Start |
本研究では、連続的に変化する細胞状態において遺伝子発現の遺伝的多様性を単一サンプル(N=1)で解析するin vitroシステムの構築を目指す。これは、(1)CRISPR転写抑制(CRISPRi)技術、(2)ヒト多能性幹細胞(ES/iPS細胞)を分化誘導する細胞工学技術、(3)一細胞RNA解析技術、そして(4)ガウス過程モデルの４つの最新技術を組み合わせることで可能となる。この全く新しいin vitroシステムの力を示す一例として、統合失調症の発症に関連する遺伝子多型を大脳皮質神経分化トラジェクトリにマップし、責任遺伝子および治療・創薬ターゲットとなる神経細胞集団を一細胞分解能で同定する。
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、従来のeQTL解析のような遺伝的背景の異なる多くのドナーから得られた検体を用いるかわりに、最新のゲノム編集技術のひとつであるCRISPR遺伝子転写抑制(CRISPRi)と一細胞RNA解析技術を組み合わせることで、大規模なサンプル数が不要で、且つ特定の細胞タイプに捉われない汎用なin-vitroシステムの構築を目指す。研究実施計画に従い、令和6 年度には、最新の統合失調症ゲノムワイド関連解析(Trubetskoy et al. Nature 2022, PMID: 35396580)によって同定された11,703箇所の関連多型の周辺に設計されたgRAN libraryをヒトES細胞に導入し、3D培養システムを用いて大脳皮質オルガノイドの構築を行った。パイロット研究として10x NEXT-GEM 2kitを用いて2つのタイムポイントにおける合計24,876細胞のシングルセルRNA解析を行い、ガウス過程潜在変数モデルを用いて次元圧縮後に抑制神経トラジェクトリの推定を行った。このトラジェクトリ上で発現している遺伝子に対して、ガウス過程回帰モデルを用いて導入された各gRNAとの相関解析を網羅的に行った結果、DLX1遺伝子において、近傍のgRNAの有無によって著しい発現の低下を観測した。このgRNAは統合失調症と関連のあるSNP (chr2:172092378:T>G) の近傍に設計されており、DLX1の下流に存在する調節領域の機能がCRISPRiによって低下していることが示唆された。このパイロット・データによって、本研究で提案するシステムが十分に機能していることがすでに示されている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
ヒトES細胞を用いた大脳皮質オルガノイドの生成が予定よりも早く進行したため、パイロット解析として小規模なシングルセルRNA解析を行うことができた。その結果、CRISPRiが有意に遺伝子発現を抑制している遺伝子と非コード領域のgRNAのペアを同定する事ができたため。
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| Strategy for Future Research Activity |
令和７年度には、パイロット解析の結果を踏襲し、あらたに追加した神経成熟の4つのタイムポイントにおける合計30万細胞弱のシングルセルRNA解析を実施する予定である。その結果から遺伝子とgRNAの神経成熟トラジェクトリにおける大規模な関連解析を実施し、ゲノムワイドに網羅的なCRISPR-eQTLの同定を強力に推進する予定である。今回のパイロット解析の結果から、gRNAが一細胞に平均5種類程度しか導入されないことが明らかになり、より多くのgRNAを解析するためには、より多くの細胞数が必要であることが明らかになった。この課題を克服するために、現在Parse Biosciences社の提案している組み合わせバーコードシステムによるスケーラビリティ向上を検討している。
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