| Project/Area Number |
24K02215
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 48030:Pharmacology-related
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| Research Institution | Kyushu University |
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Principal Investigator |
久場 敬司 九州大学, 医学研究院, 教授 (10451915)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
山口 智和 九州大学, 医学研究院, 助教 (30749940)
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| Project Period (FY) |
2024-04-01 – 2027-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2024)
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| Budget Amount *help |
¥18,590,000 (Direct Cost: ¥14,300,000、Indirect Cost: ¥4,290,000)
Fiscal Year 2026: ¥6,110,000 (Direct Cost: ¥4,700,000、Indirect Cost: ¥1,410,000)
Fiscal Year 2025: ¥6,240,000 (Direct Cost: ¥4,800,000、Indirect Cost: ¥1,440,000)
Fiscal Year 2024: ¥6,240,000 (Direct Cost: ¥4,800,000、Indirect Cost: ¥1,440,000)
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| Keywords | RNA / CCR4-NOT / 心不全 / 蛋白間相互作用 / CNOT10 |
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| Outline of Research at the Start |
心不全における転写後RNA制御の役割や機能連関については不明な点が多い。CCR4-NOT複合体はRNA分解を介して心臓の恒常性維持に寄与するが、翻訳・転写にもかかわり、かつ複合体の構成因子や結合因子により機能や局在が動的に変化するため、生理的な制御機構は不明である。私達はCCR4-NOTの構成因子のモジュールを介したサルコメア・細胞骨格の維持あるいは転写・ゲノム安定性の制御作用を見出している。本研究では、心不全ストレス応答におけるCCR4-NOT構成モジュールの相互作用蛋白ならびに標的RNA認識の分子機構を明らかにし、新たな心不全治療薬の開発につながる分子的基盤を構築する。
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| Outline of Annual Research Achievements |
今年度は、CCR4-NOTモジュールの蛋白質間相互作用(PPI)を解明するための検討を進めた。細胞内in situ結合アッセイである近位依存性ビオチン標識法により網羅的な結合蛋白の探索を行うために、AirIDと呼ばれる近接蛋白をビオチン化する酵素とCNOT4蛋白との融合蛋白をHEK293細胞内に発現させて、ビオチン化された結合蛋白をStreptavidinビーズで精製し、質量分析で結合蛋白の同定を試みた。しかしながら、AirIDとCNOT4との融合蛋白は非特異的な蛋白分解が起こりアッセイを進めることができなかったことから、TurboIDならびにAPEX2といった別の近接蛋白標識酵素のシステムで検討したところ、問題なく融合蛋白を発現させることができ、既知の結合蛋白CNOT9のビオチン標識も確認することができた。さらに、APEX2では近接蛋白のみならず近接RNAもビオチン標識することができるので、結合蛋白と結合RNAの両者を効率良く探索することができるようになった。CNOT4+9モジュールのみならずCNOT10+11モジュールについても同様に進めている。また、CNOT4欠損マウスならびにCNOT10欠損マウスの心臓の詳細な表現型の解析や初代培養の心筋細胞でのミトコンドリア形態やサルコメア構造の解析から、CNOT4によるプロテオスターシスの制御機構ならびにCNOT10によるチューブリンの蛋白修飾の制御機構に関する新たな知見を得ることができた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
CCR4-NOTモジュールの蛋白質間相互作用(PPI)を解明するため、細胞内in situ結合アッセイである近位依存性ビオチン標識法による結合蛋白の同定を試みた。AirIDビオチン化酵素とCNOT4蛋白との融合蛋白を培養細胞で発現させて、結合蛋白を同定する検討を行った。しかしながら、AirIDとCNOT4との融合蛋白は非特異的な蛋白分解が起こりアッセイを進めることができなかったので、TurboIDならびにAPEX2といった別の近接蛋白標識酵素のシステムで検討したところ、問題なく融合蛋白を発現させることができ、既知の結合蛋白のビオチン標識も確認することができた。近接蛋白のみならず近接RNAもビオチン標識することができるさらに、APEX2を用いて、結合蛋白と結合RNAの両者を効率良く探索することを進めている。CNOT4+9モジュールのみならずCNOT10+11モジュールについても同様に進めている。とりわけCNOT10+CNOT11+CNOT1 HEAT domainの複合体の立体構造が明らかとなったので、これらの3量体のみならずCNOT11のantenna domainを用いた解析を進める。また、CNOT4欠損マウスならびにCNOT10欠損マウスの心臓の詳細な表現型について、初代培養の心筋細胞でのミトコンドリア形態やサルコメア構造の解析を進めた結果、CNOT4+9モジュールによるタンパク恒常性の制御機構ならびにCNOT10+11モジュールによるチューブリンの蛋白修飾の制御機構に関する新たな知見を得ることができた。
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| Strategy for Future Research Activity |
APEX2の近接ビオチン標識により、結合蛋白と結合RNAの一次スクリーニングを行う。初代培養の心筋細胞を用いて、架橋剤による結合蛋白連結の方法で結合蛋白の二次スクリーニングを行う。CNOT10欠損による微小管構成タンパク質の発現や翻訳後修飾、微小管関連mRNAの発現、脱アデニル化の変化をそれぞれWestern blot、qPCR、mRNA poly(A)鎖測定(PAT assay)により解析する。前述の検討で同定されたCNOT10+11モジュールに重要なPPIならびにRNA－蛋白質ネットワークを、CNOT10のドメイン構造とその機能連関について詳細に解析する。さらに、微小管制御は細胞骨格のみならず、一次繊毛の構造維持にも不可欠であることから、抗アセチル化チューブリン抗体の免疫染色で検証し、一次繊毛の機能制御とその破綻による心不全の病態形成の可能性も模索する。
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