| Project/Area Number |
24K08178
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 27040:Biofunction and bioprocess engineering-related
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| Research Institution | Aichi Institute of Technology |
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Principal Investigator |
金岡 英徳 愛知工業大学, 工学部, 准教授 (30631973)
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| Project Period (FY) |
2024-04-01 – 2027-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2024)
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| Budget Amount *help |
¥4,680,000 (Direct Cost: ¥3,600,000、Indirect Cost: ¥1,080,000)
Fiscal Year 2026: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000)
Fiscal Year 2025: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000)
Fiscal Year 2024: ¥2,600,000 (Direct Cost: ¥2,000,000、Indirect Cost: ¥600,000)
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| Keywords | 乳酸菌 / 経口ワクチン / 環状ヌクレオチド / 粘膜ワクチン |
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| Outline of Research at the Start |
粘膜ワクチンのキャリアとして乳酸菌の利用が注目されている。乳酸菌はこれまでの食経験から安全性が確認されており、乳酸菌による粘膜免疫の活性化はプロバイオティクスとして広く知られている。しかし、乳酸菌を用いた粘膜ワクチンの免疫活性能（アジュバント効果）は実用化するには十分ではない。そこで本研究では、アジュバント効果の向上を目指した新たな遺伝子組換え乳酸菌の開発を行う。
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、鳥インフルエンザなどの感染症に対抗するため、家禽の免疫力を活性化する目的で乳酸菌に着目した。乳酸菌はプロバイオティクスとして、腸内環境を整えるだけではなく、経口ワクチンのキャリアとしての利用が検討されている。我々は遺伝子組換え技術により免疫活性化能（アジュバント効果）が向上した乳酸菌の開発を目的とした。
乳酸菌などのグラム陽性菌に広く分布する環状ジヌクレオチドは、ヒトで免疫応答を活性化することが報告され、その中でも環状ジアデニル酸(c-di-AMP)は抗がん剤や粘膜ワクチンのアジュバントとしての効果が期待されている。細胞内のc-di-AMPレベルは、c-di-AMP合成酵素であるdiadenylate cyclase (DAC)とc-di-AMP分解酵素であるphosphodiesterase（PDE）によって制御されているため、これらの遺伝子をターゲットとした。
乳酸菌Lactococcus lactis subsp. cremoris (L. cremoris)とLacticaseibacillus casei (L. casei)のc-di-AMP分解酵素GdpPおよびNrnAの遺伝子破壊株樹立のために温度感受性ノックアウトプラスミドを作製し、それぞれの乳酸菌に形質転換したところ、複数のコロニーが得られた。コロニーPCRでプラスミドの導入は確認でき、現在はノックアウト株の最終確認を行なっている。
また、c-di-AMPのアジュバンド効果を確認するために、L. cremorisのc-di-AMP合成酵素CdaA過剰発現株を用いた検討を行った。培養細胞株THP-1をマクロファージ様に分化誘導し、L. cremorisの野生株とcdaA過剰発現株を添加したところ、野生株と比較して炎症生サイトカインTNF-αおよびIFN-βが有意に誘導されていることが確認できた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初の予定通り、c-di-AMP分解酵素GdpPおよびNrnA遺伝子破壊株樹立のための温度感受性ノックアウトプラスミドが作製でき、コロニーPCRにて乳酸菌へのプラスミド導入が確認できた。また、L. cremorisではc-di-AMP合成酵素CdaA過剰発現株を用いることにより、宿主免疫の活性化を確認することができた。
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| Strategy for Future Research Activity |
申請書の実験計画に基づいて、以下の検討項目課題を行う。
・L. cremorisとL. caseiにおいて、前年度から引き続きc-di-AMP分解酵素の遺伝子破壊株の樹立を行い、樹立ができたら細菌内のc-di-AMP濃度の測定と、抗生物質耐性の評価などの表現型の解析を行う。
・c-di-AMP分解酵素の遺伝子破壊株が樹立できたら、c-di-AMPを細胞外に排出するMDRタンパク質の高発現変異を追加で導入し、c-di-AMP高分泌株の樹立を行う。
・L. caseiにおいても、CdaA過剰発現株を樹立し、その免疫活性化能を確認する。マクロファージ様に分化培養したTHP-1を用いて、いくつかの炎症生サイトカインの発現誘導を定量PCRにより解析する。
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