| Project/Area Number |
24K08666
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 38020:Applied microbiology-related
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| Research Institution | The University of Tokushima |
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Principal Investigator |
川上 竜巳 徳島大学, 大学院社会産業理工学研究部(生物資源産業学域), 准教授 (90380120)
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| Project Period (FY) |
2024-04-01 – 2027-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2024)
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| Budget Amount *help |
¥4,680,000 (Direct Cost: ¥3,600,000、Indirect Cost: ¥1,080,000)
Fiscal Year 2026: ¥910,000 (Direct Cost: ¥700,000、Indirect Cost: ¥210,000)
Fiscal Year 2025: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
Fiscal Year 2024: ¥2,470,000 (Direct Cost: ¥1,900,000、Indirect Cost: ¥570,000)
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| Keywords | D-アミノ酸 / 超好熱アーキア / 遺伝子発現 / トランスポーター / 転写因子 / アミノ酸ラセマーゼ |
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| Outline of Research at the Start |
高等生物やバクテリアにおいて、D-アミノ酸が重要な生理機能を担うことが分かってきている。申請者は、第三の生物に分類される超好熱アーキアもD-アミノ酸に対して生理的な作用を示すことを初めて明らかにした。本研究では、2種類のD-アミノ酸代謝酵素（アミノ酸ラセマーゼ）の遺伝子発現条件の解析と関連タンパク質の機能構造解析によって、D-アミノ酸を介した遺伝子発現制御機構を明らかにするとともに、アーキアにおけるD-アミノ酸の生理的な機能について考察する。
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| Outline of Annual Research Achievements |
我々はこれまでに、低基質特異性アミノ酸ラセマーゼ（BAR）、Ala/Ser特異的ラセマーゼ（ASR）という2種類のD-アミノ酸代謝酵素を超好熱アーキアPyrococcus horikoshiiに見出している。BAR遺伝子は機能未知タンパク質遺伝子及び転写因子タンパク質遺伝子とクラスターを形成しており、遺伝子発現解析によりBARと機能未知タンパク質が転写因子による制御を受けていることが示唆されている。この機能未知タンパク質は膜タンパク質であると推定されることから、D-アミノ酸に取り込みに関与していると考えられる。まず、この膜タンパク質の解析を試みた。BARが高発現する条件と高発現しない条件でP. horikoshiiを培養し、回収した菌体の膜画分を調製して、SDS-PAGEによる発現量の比較や推定分子量付近のタンパク質のnano-LC/MS/MS解析などを行ったが、まだ目的タンパク質の検出には至っていない。一方で、このタンパク質の大腸菌発現についても検討した。タンパク質発現用ベクターでの発現は認められなかったが、BARクラスター全体を含むベクターを導入した大腸菌からBAR活性を検出できたことから、大腸菌でもBARクラスターの発現制御システムが機能していることが示唆された。現在、目的の膜タンパク質も同時に発現しているかを検討している。
転写因子タンパク質に関しては、リガンドであるL-Ile、D-allo-Ileとの共結晶構造やDNAとの結合活性について明らかにしている。今回、様々なDNAプローブを作製してEMSA解析を行い、この転写因子タンパク質と結合するDNA配列の特定を行った。現在、特定したDNA配列と転写因子タンパク質との共結晶スクリーニングを進めている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度は、D-アミノ酸の取り込みに関与すると考えている膜タンパク質の解析を中心に行った。P. horikoshii菌体（膜画分）からのタンパク質レベルでの検出や大腸菌を用いたタンパク質の高発現には至らなかったが、遺伝子クラスター全体を含むベクターを用いた実験結果は、このクラスターが大腸菌体内でも機能していることを強く示唆しており、本手法を基盤として解析することでこの膜タンパク質の大腸菌での発現やトランスポーター活性の解析などが行えることが期待できる。転写因子と結合するDNA配列の特定も進展し、転写因子―DNA複合体の構造解析のステップに進めたことから、本研究はおおむね順調に進行していると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
膜タンパク質の解析については、各遺伝子にヒスタグ配列などを付加することにより抗体での検出や精製を可能にできると考えており、まず、各タンパク質のN末端にヒスタグ配列を付加した発現系を構築する。BAR自身の機能解析により特定のアミノ酸変異により活性が消失することが分かっているので、変異酵素を導入した発現系を構築することにより、大腸菌体内へのD-アミノ酸の蓄積を追跡できると考えている。
もう一つのアミノ酸ラセマーゼであるASRも、BARクラスターと同様に、アミノ酸トランスポーターや転写因子とともに遺伝子クラスターを形成していることが分かっているが、現在までに遺伝子発現の制御を受ける条件が分かっていない。ASR転写因子の大腸菌発現系は構築できているため、結晶構造解析を行うことにより構造からの機能推定を試みる予定である。
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