| Project/Area Number |
24K08676
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 38020:Applied microbiology-related
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| Research Institution | Obihiro University of Agriculture and Veterinary Medicine |
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Principal Investigator |
福田 健二 帯広畜産大学, 畜産学部, 教授 (80419217)
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| Project Period (FY) |
2024-04-01 – 2027-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2024)
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| Budget Amount *help |
¥4,550,000 (Direct Cost: ¥3,500,000、Indirect Cost: ¥1,050,000)
Fiscal Year 2026: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000)
Fiscal Year 2025: ¥1,820,000 (Direct Cost: ¥1,400,000、Indirect Cost: ¥420,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
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| Keywords | 乳酸菌 / ムーンライティングタンパク質 / 宿主接着 / 抗生物質耐性 |
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| Outline of Research at the Start |
乳酸菌の中には菌体表層にムーンライティングタンパク質（MP）を発現するものがあり、これは宿主接着に関与すると考えられている。一部の病原菌にも乳酸菌と共通のMPが菌体表層に局在し、宿主への接着を媒介する病原性因子として働く。そこで本研究は、菌体表層にMPが局在する乳酸菌を選抜あるいは作出し，未だ不明な部分が多いMPの菌体表層提示機構を解明し、種々のムーンライティングタンパク質を固定化した金属ナノ粒子を作製し、これら作出した乳酸菌やMP固定化金属ナノ粒子を用いた病原菌の宿主接着に対する阻害効果を検証する。
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| Outline of Annual Research Achievements |
生菌体が大部分を占める対数増殖期においてムーンライティングタンパク質の菌体表層提示機構のひとつとして考えられるのは、菌体透過性の一過的な上昇である。当初計画で想定したように対数増殖期において菌体膜のインテグリティが低下することにより膜内外双方向の物質移動が生じているのか、あるいは膜内部から外部へ何らかの選択的輸送機構が存在するか判別するため、ヨウ化プロピジウム（PI）の取り込みをセルソーターを用いて予備実験的に検証した。その結果、FSMM15株、FSMM22株ともに生菌体へのPIの取り込みは認められなかったことから、ムーンライティングタンパク質は菌体内から選択的輸送機構により分泌される可能性が強く示唆された。一方、FSMM22株のみ死菌体群と生菌体群の中間の蛍光強度を示す生菌が存在したことから、FSMM22にはPIを結合する菌体表層成分の含まれることが示唆された。両菌株の菌体表層成分をフェノールまたはリゾチームを用いて抽出し陰イオン交換カラムクロマトグラフィーで分離した結果、FSMM22株の菌体表層は酸性成分（酸性糖及び酸性タンパク質）を有意に多く含むことが示された。従って、ムーンライティグタンパク質をより多く菌体表層に提示する乳酸菌は、対数増殖期に何らかの選択的輸送機構を有し、かつムーンライティングタンパク質を固定するカウンターパートとなる成分を菌体表層に多く含むことが必要条件であることが示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
当初、RNAポリメラーゼの菌体表層局在性を指標として菌体透過性の上昇、およびムーンライティングタンパク質が菌体表層に多く局在している乳酸菌を選抜しようと計画した。しかし、初年度の実験結果により菌体透過性ではなく何らかの選択的輸送機構によるムーンライティングタンパク質の分泌が示唆されたことから、当初計画を変更したため。
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| Strategy for Future Research Activity |
ムーンライティングタンパク質の選択的輸送機構の候補として膜小胞による輸送が挙げられる。対数増殖期における菌体培養液の電子顕微鏡観察により菌株間で膜小胞の有無における相違を確認する。膜小胞が確認された場合、これを単離し内部に含まれるタンパク質成分をプロテオーム解析により明らかにする。膜小胞が確認されない場合は両菌株の全ゲノム比較解析を実施し、ムーンライティングタンパク質の輸送に関わるトランスポーターの検索を行う。両菌株の菌体表層成分の精製を進め、質量分析器等を用いて同定を試みる。2年度に計画していたEDTAやポリカチオン等を用いたムーンライティングタンパク質を多く菌体表層に局在する乳酸菌の作出は保留する。2年度以降に計画していたムーンライティングタンパク質固定化金属ナノ粒子の作製とその抗菌活性の検証は当初計画通り進める。
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