| Project/Area Number |
24K08708
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 38030:Applied biochemistry-related
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
稲葉 理美 北海道大学, 先端生命科学研究院, 助教 (70785493)
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| Project Period (FY) |
2024-04-01 – 2027-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2024)
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| Budget Amount *help |
¥4,680,000 (Direct Cost: ¥3,600,000、Indirect Cost: ¥1,080,000)
Fiscal Year 2026: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
Fiscal Year 2025: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
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| Keywords | クライオ電顕 / 膜タンパク質 / 抗菌ペプチド輸送 / トランスポータ |
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| Outline of Research at the Start |
抗生物質に対する微生物の薬剤耐性が現代の深刻な社会課題となっている。本研究では、微生物による薬剤耐性の治療薬として期待される抗菌ペプチドが、感染症の原因となるグラム陰性細菌の細胞内に入り込む機構を明らかにする。これらの抗菌ペプチドを細胞内に取り込む膜タンパク質に着目し、輸送する化学構造の特性や、輸送過程の詳細を解き明かすことで、グラム陰性細菌は自身の生育にとって毒性を示す抗菌ペプチドをなぜ低い基質特異性で取り込むようになったのかを考察する。
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| Outline of Annual Research Achievements |
2024年度はSbmAのクライオ電顕による構造解析とダイナミクス解析を中心に進めた。まず、クライオ電子顕微鏡に用いる試料調製条件 (溶液, pH, 膜環境等) を検討した。精製したSbmAに加えて、共同研究者によって取得された抗SbmA抗体を用いて、酵素処理及びカラム精製を経てFabフラグメントを調製した。SbmAとFabを混合し、SECにより複合体を精製した。次に、人工脂質(ナノディスク)への再構成条件の検討を行った。種々の条件を検討したところ、溶液のpHを変えることで、2021年に報告した外開き構造とは異なる、内向き構造の存在が多くなることが判明した。そこで内向き構造の決定を目的に、クライオ電顕単粒子解析を行ったところ、3.5[A]以上の分解能で構造を決定することに成功した。興味深いことに、今回測定した条件においては、細胞質側の開き具合の異なる2つの内向き構造が存在することが明らかとなった。SbmAのコアドメインを構成する12本のヘリックスのうち、顕著にコンフォメーションが変化する部位を特定することにも成功した。得られたクライオ電顕構造をもとに、ダイナミクス解析を行うための試料準備を進めた。変化の大きなヘリックスを連結するループ部位に、スピンラベルを施すために、SbmAのもつシステイン残基を欠損させ、新たにラベル部位にシステイン残基導入した変異体を複数デザインした。現在、これらの中から発現が良好な変異体を用いて、ラベル化などの検討を進めている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
申請時に記載していた年次計画のうち、複合体の解析を除いて概ね順調に進んでいる。複合体解析については、適切な基質を再度検討する必要がある。
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| Strategy for Future Research Activity |
スピンラベルの条件を検討し、複数の溶液条件下(pHや基質の有無などを変える)でダイナミクス解析を行う。合わせて、クライオ電顕による複合体の解析も進める。
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