機能性物質の探索と解析に資する簡便な細胞外小胞産生アッセイ系の構築と検証

• Project/Area Number: 24K08769
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 38050:Food sciences-related
• Research Institution: Iwate Medical University
• Principal Investigator: 東尾 浩典 岩手医科大学, 教養教育センター, 准教授 (50342837)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 齋野 朝幸 岩手医科大学, 医学部, 教授 (40305991) ; 横山 拓矢 岩手大学, 農学部, 准教授 (70772094)
• Project Period (FY): 2024-04-01 – 2027-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2024)
• Budget Amount: ¥4,680,000 (Direct Cost: ¥3,600,000、Indirect Cost: ¥1,080,000); Fiscal Year 2026: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000); Fiscal Year 2025: ¥1,820,000 (Direct Cost: ¥1,400,000、Indirect Cost: ¥420,000); Fiscal Year 2024: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
• Keywords: 細胞外小胞 / 蛍光タンパク質 / 蛍光定量 / ライブイメージング / 分泌刺激 / 機能性物質 / 動物培養細胞 / マスト細胞株

Outline of Research at the Start

細胞外小胞は、産生細胞由来のタンパク質・RNA・脂質等を標的細胞に送り届け、標的細胞の機能を制御するための細胞間情報伝達ツールであることが解明されつつある。
細胞外小胞の役割が解明されるほどに、その働きを制御するための機能性物質の探索が活発化すると想定される。しかし、細胞外小胞はサイズの小ささゆえ定量や解析が難しく、機能性物質の探索に活用可能な細胞外小胞産生アッセイ系は「一般的な実験室レベルでは」まだ無い。本研究では、細胞外小胞産生過程のライブイメージング技法を活用し、簡便かつ多検体解析が可能な細胞外小胞産生アッセイ系の構築を試みる。

Outline of Annual Research Achievements

細胞外小胞(EV)は産生細胞由来のタンパク質・RNA・脂質等を含有しており、細胞間情報伝達ツールとして、様々な生体機能の制御や疾患の発症に関与している。本研究では、EVの産生を制御する機能性物質の探索に資する、実験室レベルの簡便なEV産生アッセイ系の構築を蛍光タンパク質を用いて試みている。今年度は、細胞膜由来EV（マイクロベシクル）と多胞体由来EV（エクソソーム）を蛍光標識するためのマーカータンパク質をそれぞれ作製し、分泌刺激依存的なEV産生を示すマスト細胞を用いて機能確認を行なった。細胞膜タンパク質c-kitの細胞質側に近赤外光タンパク質miRFP713を融合して細胞膜のマーカーとした。また、多胞体由来EVに含まれる膜タンパク質の内腔側に赤色蛍光タンパク質mCherryを、細胞質側にpH感受性緑色蛍光タンパク質pHluorinを融合して多胞体由来EVのマーカーとした（EVの多様性を考慮し3種類）。3Dタイムラプスイメージングでは、各マーカーの細胞内局在はほぼ狙い通りであり、分泌刺激依存的にこれらの蛍光が大小の膜構造として細胞外液へ放出されることを確認した。またこのイメージングでは、（細胞外液に触れると蛍光を発するはずの）pHluorinが蛍光を伴わずに細胞外へ放出されるなど、放出された膜構造にバリエーションがあることを示唆する結果も得られた。そこで現在、プレートリーダーで細胞外液の蛍光を定量するための至適条件の検討（細胞数／細胞外液量／刺激時間など）をしつつ、フローサイトメーターを用いた膜構造の解析（サイズ／量／蛍光の組合せなど）も進めている。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

4種類のマーカータンパク質の作製にあたり、細胞内局在や機能を喪失しない、蛍光タンパク質融合部位および挿入部位の同定、および発現量の調節（プロモーター選択）に時間を要した。そのため、蛍光定量条件の検討および放出された膜構造の解析への着手が、当初計画よりもやや遅れている。

Strategy for Future Research Activity

まずは研究目的に沿って、細胞外液の蛍光定量条件の至適化ののち、蛍光強度と実際のEV産生量との連関を生化学的手法やフローサイトメトリーにて検証する。その後、細胞膜由来EVと多胞体由来EVの産生を阻害する化合物、およびこれらのEV産生に働く遺伝子のノックダウンを用いて、EV産生アッセイ系としての感度や限界などを探る。
一方で、上記を優先しつつ、細胞外に放出される膜構造のバリエーションを形態学的・生化学的手法で追究する。