スプライシングにおけるイントロン認識機構と病気発症メカニズムの解明

• Project/Area Number: 24K09342
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 43020:Structural biochemistry-related
• Research Institution: Shimane University
• Principal Investigator: 尾林 栄治 島根大学, 学術研究院医学・看護学系, 准教授 (50321740)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 浦野 健 島根大学, 学術研究院医学・看護学系, 特任教授 (70293701)
• Project Period (FY): 2024-04-01 – 2027-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2024)
• Budget Amount: ¥4,680,000 (Direct Cost: ¥3,600,000、Indirect Cost: ¥1,080,000); Fiscal Year 2026: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000); Fiscal Year 2025: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000); Fiscal Year 2024: ¥1,820,000 (Direct Cost: ¥1,400,000、Indirect Cost: ¥420,000)
• Keywords: RNAスプライシング / 立体構造解析 / 構造解析

Outline of Research at the Start

近年、骨髄異形成症候群（MDS）の患者や、肺がんなどの固形腫瘍を持つ患者のゲノム解析がなされ、その患者の多くがスプライシングタンパク質に特異的なアミノ酸変異を持つことが報告された。実際にこれらのいくつかのアミノ酸変異は、細胞におけるスプライシングパターンに大きな違いを引き起こすことが報告されているが、それぞれの変異タンパク質がどのように働く、もしくは働かないことで違い（異常）を産むのかは明らかではない。そのため、これらアミノ酸変異のスプライシングへの影響を知ることは、病気の早期診断・新規薬剤開発につながり、世界的に注目されており、本研究を進めることの意義は大きい。

Outline of Annual Research Achievements

本研究では、MDSやがん患者に見られるスプライシングタンパク質のアミノ酸変異が、なぜスプライシング異常を引き起こし、病気の原因になりうるのかを明らかにすることを目的に実験を行っている。
目的タンパク質の１つであるZRSR2に関して、ZRSR2はSF3B1と相互作用することが明らかになったため（論文未発表）、ZRSR2とSF3B1の複合体での調製をおこなってきた。しかしこれまでのところ、構造解析可能な結晶は得られていない。同時に、病気患者に見られるZRSR2の変異体を作成したところ、ZRSR2のRNA結合部位の変異は、SF3B1への結合を失わせるとの結果を得た。しかし機能未知部位における変異はSF3B1との結合に影響しなかったことから、機能未知部分はスプライシング反応中に他のスプライシングタンパク質と相互作用するのではないかと考え、その相互作用解析を進めている。
もう一つの目的タンパク質であるU2AF1に関して、His37のメチル化修飾のスプライシングへの影響を明らかにすることを目的としている。これまでのところ、メチル化修飾酵素とU2AF1を大腸菌内で共発現させることで、U2AF1のHis37がメチル化されたタンパク質を調製することに成功した。現在は、メチル化されたU2AF1のRNA結合能が、メチル化されていないU2AF1と違いがあるのか、そのRNA結合親和性を調べているところである。同時に結晶化も進めているが、現在までに良質な結晶は得られていない。
さらに、スプラシング初期におけるイントロン認識機構を知るために、初期スプライシング認識複合体SF1-U2AF2-U2AF1の調製を行ってきた。本複合体は、３量体で調製出来るものの、SF1の結合が不安定で解離しやすかった。結合の安定化にはSF1のリン酸化が重要との報告もあり、現在リン酸化修飾SF1の調製を試みている。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

構造解析を行う予定のタンパク質、U2AF1およびZRSR2の結晶化を試み、まだ高分解能解析に十分な結晶は得られていない。しかし、タンパク質の結晶化および最適な条件検索には時間がかかることは予想されており、想定内である。すでにタンパク質の大量発現系および精製法の確立には成功しているので、今後も順調に研究を進めて行くことができると期待される。また、複合体を安定化させるタンパク質修飾も進んでおり、構造解析に向けた準備は整いつつあると考えている。
さらにZRSR2に関しては、機能未知部分がどのように結晶化に影響しているか不明である。しかし機能未知部分と相互作用するタンパク質が明らかになれば、その部分の構造安定化につながり、結晶化も進むと期待される。

Strategy for Future Research Activity

引き続き、U2AF1およびZRSR2の結晶構造解析を目指して、タンパク質の結晶化条件の検索を行なっていく。また、ZRSR2に関しては機能未知部分と他のタンパク質との相互作用解析を進めていく。
また結晶化及び構造解析のために、タンパク質修飾などを行い、タンパク質複合体の安定化を行なっていく。
もう１つの目的であるアミノ酸変異特異的モノクローナル抗体の作成についても、積極的に進めていく予定である。