DNA修復阻害によるトリソミックレスキュー法の構築

• Project/Area Number: 24K11041
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 52050:Embryonic medicine and pediatrics-related
• Research Institution: Mie University
• Principal Investigator: 脇田 幸子 三重大学, 医学系研究科, 技術員 (20782981)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 橋詰 令太郎 三重大学, 医学系研究科, 講師 (50456662)
• Project Period (FY): 2024-04-01 – 2028-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2024)
• Budget Amount: ¥4,680,000 (Direct Cost: ¥3,600,000、Indirect Cost: ¥1,080,000); Fiscal Year 2027: ¥260,000 (Direct Cost: ¥200,000、Indirect Cost: ¥60,000); Fiscal Year 2026: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000); Fiscal Year 2025: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000); Fiscal Year 2024: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
• Keywords: CRISPR/Cas9 / dCas / トリソミックレスキュー / トリソミックレスキュ― / SNP / dCas9

Outline of Research at the Start

本研究では、ゲノム編集を利用しない後天的アレル特異的トリソミックレスキュー法を構築する。臨床応用を想定した安全面、倫理的、および技術的にも課題が少ない、アレル特異的DNA修復阻害を利用する。具体的には、①dCas9-変異XPCプラスミドの作製、②Down症由来iPS細胞における培養細胞での核型修正評価、さらに良好な結果が得られた場合には、③DS iPS由来テラトーマ形成マウスにおける核型修正評価を行う。くわえて、安全なドラッグデリバリーシステムとして、エクソソーム内封入方法の確立を行う。

Outline of Annual Research Achievements

ダウン症候群（DS）における知的障害を後天的に改善させることを最終目標とし、trisomy細胞の過剰染色体1本を完全消去することで後天的核型修正を目指している。一見、乱暴な方法のようではあるが、21番染色体が1本多いことによる様々な病態は、染色体上の複数の遺伝子間ネットワークやクロマチン構造変化などを介するゲノム全体の複合要因があると考えられており、過剰な21番染色体自体を消去することが根本的改善に直結すると申請者らは考える。 従来、非増殖細胞においては、DNA 二重鎖切断が自然発生することは非常に少ないとされてきたが、これら非増殖細胞（神経細胞、心筋細胞）においても、DNA 二重鎖切断が常時頻繁に発生していることが 2016 年に報告された。この恒常的な DNA 切断現象は、二重鎖 DNA のトポアイソマーの変換や、「ねじれ」ないし「ひずみ」の解除に必須である。切断に伴う DNA 修復機構に関する知見のうち、我々は、その修復機構の1つに与る蛋白質、C 群色素性乾皮症原因遺伝子産物（Xeroderma pigmentosum, complementation group C: XPC）に注目した。XPC は、1 細胞あたり約 10 万回/日の頻度で切断されている DNA を修復する際の初動的な役割を担っている。本研究は、DS の iPS 細胞を用いて、ドミナントネガティブ作用のある変異 XPCを特定の染色体に結合させ、DNA 修復を阻害することにより、細胞からの当該染色体全体の自然消去を誘導する。
gRNAは、特定の21番相同染色体に特有な一塩基多型（SNP）情報（ハプロタイプ情報）を用いて68個設計し、その選定を行っている最中である。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

より効率的に作用するgRNAの選定を行っており、設計、プラスミド作製、細胞評価に時間がかかっているため。

Strategy for Future Research Activity

gRNAの選定後、さらに標的染色体による効果の差を検討したいと考えている。