アデノウイルスを用いた緑膿菌ワクチンの検討

• Project/Area Number: 24K11346
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 53030:Respiratory medicine-related
• Research Institution: Oita University
• Principal Investigator: 藤島 宣大 大分大学, 医学部, 病院特任助教 (20992712)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 平松 和史 大分大学, 医学部, 教授 (80301381)
• Project Period (FY): 2024-04-01 – 2027-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2024)
• Budget Amount: ¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000); Fiscal Year 2026: ¥910,000 (Direct Cost: ¥700,000、Indirect Cost: ¥210,000); Fiscal Year 2025: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000); Fiscal Year 2024: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
• Keywords: 緑膿菌 / 線毛蛋白 / アデノウイルス / ワクチン / 緑膿菌線毛 / CpG-ODN

Outline of Research at the Start

我々はこれまでに緑膿菌線毛蛋白を経気道的にマウスに免疫することで，その後の緑膿菌肺炎による致死を抑制することを示し、粘膜免疫の重要性を示してきた．本研究では, SARS-CoV-2ワクチンでも実用化されたアデノウイルスベクターを用いた緑膿菌線毛蛋白ワクチンの作成を行う．さらに粘膜免疫における強力なアジュバントと考えられているCpG-Oligodeoxynucleotides（CpG-ODN）を経気道的に同時に免疫する．その後の緑膿菌感染による肺炎に対するマウスの致死抑制効果やマウス肺内の菌量，病理所見を評価することで，緑膿菌の線毛蛋白組み込みアデノウイルス+ CpG-ODNの効果を検証する.

Outline of Annual Research Achievements

アデノウイルスベクターを用いた緑膿菌ワクチンを作成するために緑膿菌線毛蛋白遺伝子(pilA)をコスミドベクターpAxEFwtit2へ挿入する実験を行った。
①緑膿菌PAO-1株を鋳型DNAとして、ベクターのクローニングサイトに合わせた制限酵素切断部位を導入したプライマーを用いてpilAをPCR法で増幅した。PCR産物をT vectorとライゲーション後、大腸菌へ導入した。遺伝子導入した大腸菌をX-gal/IPTG＋Ampicillin含有LB培地で培養し、T vectorにpilA（pilA-T vector）が挿入されていることを確認した。pilA-T vectorを導入した大腸菌からプラスミド抽出し、プラスミドのシーケンスを行い、遺伝子配列に矛盾がないことを確認した。抽出したpilA-T vectorを、プライマーに導入していた制限酵素部位をSmaⅠにて切断し、アガロースゲル電気泳動後、ゲルから目的とするpilAフラグメント（約450bp）を抽出した。
②アデノウイルスのコスミドベクターpAxEFwtit2を大腸菌に導入した。大腸菌をampicillin含有LB培地で培養し、大腸菌からコスミドベクターpAxEFwtit2を抽出した。作成したコスミドベクターを制限酵素SmiⅠで切断し、①で作成したpilAとのライゲーションに用いた。
①および②の過程で得たpilAとpAxEFwtit2をライゲーションし、ampicillin含有LB培地で培養した。増殖したコロニーを用いて、pilAのプライマーを用いてPCRを行い、pilAが挿入されていると考えられるpAxEFwtit2を得た。現在、想定通りにpilAがpAxEFwtit2に挿入されているかについてシークエンスを行い、確認している。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

緑膿菌線毛蛋白pilA遺伝子をコスミドベクターに組み換える操作までは終了している。しかしながら、最終的な塩基配列の確認や細胞へのtransfectionによる目的蛋白の発現の確認などが実施できていない。そのため組み替えアデノウイルス作成やマウスへの組み換えアデノウイルスの感染実験は行えていない。以上より現在までの進捗状況は「やや遅れている」と判断した。

Strategy for Future Research Activity

作成した緑膿菌線毛蛋白遺伝子組み換えアデノウイルスコスミドベクターを細胞に導入し、抗緑膿菌線毛蛋白抗体を用いて、その発現を確認する。その後、組み替えDNAを細胞に導入し、アデノウイルス（pilA-Ad）を作成する。作成したpilA-Adを培養細胞に感染し、感染細胞における緑膿菌線毛蛋白の発現量について、抗緑膿菌線毛蛋白抗体を用いたWestern blot法で確認することとしている。
またアジュバントとしてCpG-ODNを用いて、pilA-Adとともにマウスに経気道的に投与し、免疫したマウスの気管支肺胞洗浄液 (BALF)を回収し、BALF中のCD11c陽性細胞数や各種サイトカインを定量し比較するとともに、マウスBALFおよび血清中の抗緑膿菌線毛IgG/IgA抗体価をELISA法で検討する。さらに免疫マウスに対して緑膿菌を経気道的に感染させ、その死亡率をコントロール群と比較することで、致死抑制効果を検証する。