日本人嚢胞性線維症患者由来iPS細胞を用いた汎粘膜改善薬の探索

• Project/Area Number: 24K11354
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 53030:Respiratory medicine-related
• Research Institution: Kansai Medical University
• Principal Investigator: 山下 裕美 関西医科大学, 医学部, 助教 (30594890)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 服部 文幸 関西医科大学, 医学部, 教授 (50398624)
• Project Period (FY): 2024-04-01 – 2027-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2024)
• Budget Amount: ¥4,550,000 (Direct Cost: ¥3,500,000、Indirect Cost: ¥1,050,000); Fiscal Year 2026: ¥650,000 (Direct Cost: ¥500,000、Indirect Cost: ¥150,000); Fiscal Year 2025: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000); Fiscal Year 2024: ¥2,860,000 (Direct Cost: ¥2,200,000、Indirect Cost: ¥660,000)
• Keywords: 嚢胞性線維症 / CFTR / 疾患特異的iPS細胞 / 薬剤スクリーニング

Outline of Research at the Start

嚢胞性線維症(CF)は、cystic fibrosis transmembrane conductance regulator（CFTR）を原因分子とする遺伝性疾患である。CFTRは陰イオンチャネルであり、この遺伝的変異の結果、全身の粘液の異常をきたす。研究代表者らは、日本人のCF患者由来の線維芽細胞を入手し、iPS細胞(jCF-iPS)の樹立に成功した。この細胞のCFTRの変異は、これまで報告のない、機能を完全に欠損した変異であった。本研究では、このjCF-iPSから分化した気管上皮細胞を用いて、粘液を改善する薬剤を網羅的に探索することで、CFTRを介さない新しい治療法の発見を目指す。

Outline of Annual Research Achievements

嚢胞性線維症の原因遺伝子であるCFTRの変異により起こる肺の粘液の異常を改善する薬剤を探索することを目的とし、当初、代表者らが日本人嚢胞線維症患者の細胞から樹立したCFTR完全欠損となる変異を持つヒトiPS細胞を利用する予定であった。しかし、本iPS細胞の肺上皮細胞への分化誘導効率が低く、多数の化合物をスクリーニングするための均一な肺上皮細胞を得ることが難しい問題があった。そこで、まずはヒト肺上皮腺がん細胞であるCalu-3細胞に日本人嚢胞性線維症患者由来のiPS細胞のCFTR変異と同一部位にフレームシフト変異を導入した細胞を使用して化合物スクリーニングを実施することにした。
Calu-3細胞へのCFTR変異の導入は、CRISPR-Cas9システムで、リポフェクション法を用いて行った。トランスフェクション後、細胞のソーティング及びSingle cellからのクローニングを行った。
化合物のスクリーニング系を確立するために、Calu-3細胞（WT）を用いたスフェロイド形成及びForskolin-Induced Swelling Assays法を検討した。Calu-3細胞単独ではスフェロイドを形成しなかったが、マトリゲル内で培養することによりスフェロイドを形成することを見出した。また、5μM Forskolinを添加することにより、CFTRが活性化し、スフェロイドの内腔に水を取り込み、膨潤することが確認できた。
化合物の入手については、東京大学大学院薬学系研究科附属創薬機構に申請し、プレゼンを行った結果、アッセイ系確立の進捗次第で化合物ライブラリーを提供して頂けることになった。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

これまで、Calu-3細胞にCFTR変異を導入するために、数回トランスフェクションを行ったが、プラスミドが細胞内に導入された細胞（GFP陽性）をFACSソーティング後、single cellから増殖培養させることが１回しか出来なかった。
Calu-3細胞は安定的な培養が難しく、特にSingle cellから増殖させることが難しく、増殖せず死んでしまったり、生存しても増殖させるまでに培養期間がかかってしまったため。

Strategy for Future Research Activity

Calu-3細胞のトランスフェクション後に培養出来た9クローンについて、ウェスタンブロットを行い、CFTRタンパクが欠損しているかどうかを調査する。変異が入っておらずCFTRタンパクの発現が見られた場合、再度、CRISPR-Cas9のトランスフェクションを実施する。その際には、ソーティング後のCalu-3細胞をSNLフィーダー細胞の上で培養し、single cellからの増殖をサポートするようにする。
大学の共同機器施設内にスフェロイドの撮像と計測を得意とするCell3iMagerが導入された。本機械を用いてForskolin-Induced Swelling Assaysの化合物スクリーニングを確立する。