| Project/Area Number |
24K11619
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 54020:Connective tissue disease and allergy-related
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| Research Institution | Oita University |
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Principal Investigator |
松本 紘幸 大分大学, 医学部, 助教 (70899682)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
吉川 裕喜 大分大学, 医学部, 講師 (40774724)
平松 和史 大分大学, 医学部, 教授 (80301381)
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| Project Period (FY) |
2024-04-01 – 2027-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2024)
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| Budget Amount *help |
¥4,680,000 (Direct Cost: ¥3,600,000、Indirect Cost: ¥1,080,000)
Fiscal Year 2026: ¥780,000 (Direct Cost: ¥600,000、Indirect Cost: ¥180,000)
Fiscal Year 2025: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
Fiscal Year 2024: ¥2,340,000 (Direct Cost: ¥1,800,000、Indirect Cost: ¥540,000)
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| Keywords | SARS-CoV-2 / ACE2 / 喘息 / 吸入ステロイド薬 |
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| Outline of Research at the Start |
喘息患者は疫学的にCOVID-19に罹患しにくいことが示されているが，喘息治療に用いる吸入ステロイド薬のCOVID-19への影響については結果が一定でない。本研究では，SARS-CoV-2の気道上皮細胞への感染性に吸入ステロイド薬が与える影響について検証する。3次元細胞培養モデルを用いて, ヒト気道上皮における偽型ウイルスの感染性と感染に関連した分子発現に対する各種吸入ステロイド薬の影響を検討するとともに，マウスを用いてヒトへの感染性に関するin vivoでの各種吸入ステロイド薬の影響について検討を行う。
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| Outline of Annual Research Achievements |
Air-liquid interface（ALI）法を用いたSARS-CoV-2感染性への各種吸入ステロイド薬の影響に関する検討を行っている。気道上皮細胞は，submergedな培養ではSARS-CoV-2の受容体であるACE2は発現しにくく，線毛細胞への分化誘導を行うことで十分な発現が見られることが分かっている。そのため，ALI法による3次元細胞培養モデルの作成を試みている。ヒト気道上皮細胞をT75フラスコでALI成長培地を用いて培養して増殖させた後、細胞をウェルプレートに播種した。3日後にエアリフト処理（細胞のapical側の培地を除去）を行い、以後はbasal chamberのみにALI分化培地を添加して培養を継続した。T75フラスコでの培養では、細胞の増殖が想定よりも遅く、予定していた細胞数が得られなかった。また、ウェルプレートへの播種については、培養条件検討のために播種する細胞数をそれぞれ1,000、5,000、10,000、50,000、100,000個にしたウェルを用意した。1,000、5,000個の細胞を播種したウェルは細胞数が少なくメンブレンの一部しか細胞で覆われていなかった。10,000個を播種したウェルは、ほぼ全体が細胞で覆われており、概ね適当な細胞量と考えられた。50,000、100,000個を播種したウェルについては一部しか細胞で覆われていなかったが、この要因として細胞の懸濁が不十分で細胞分布が不均一になっていた可能性が考えられる。結果的には、いずれのウェルにおいても線毛細胞への分化は確認できなかったが、細胞株自体の問題や、細胞懸濁などの手技的な要因が考えられる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
購入した気道上皮細胞が想定通りには増殖せず、細胞ストックの作成が予定通りにはできていない。実験の回数が限られてしまい、現在追加の細胞株をオーダー中である。今回、予定の細胞数が得られなかった点については、細胞株自体の問題が考えられる他、培養期間をもう少し長くとる必要があった可能性もあり、次回別の細胞株を購入して再度検討を行う予定である。また、ウェルプレートへの播種時には、細胞懸濁が不十分で細胞分布が不均一になった可能性があり、ピペッティングなど手技的な部分についても再度検討する。
細胞の感染実験に要する偽型ウイルス作成のプロトコール検討にも、米国のマウントサイナイ医科大学所属の木村先生とオンラインで会議を行うなどして時間を要している。今後、293TNプロデューサー細胞、pPACK-SPIKEプラスミド、GFP発現レンチウイルスベクタープラスミド等を購入して偽型ウイルスを作成する予定である。
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| Strategy for Future Research Activity |
1．Air-liquid interface（ALI）法を用いたSARS-CoV-2感染性への各種吸入ステロイド薬の影響に関する検討
正常ヒト気道上皮細胞（NHBE）と喘息患者由来気道上皮細胞（DHBE）をIL-13を含む培地にて培養し，各種吸入ステロイド薬の構成成分であるシクレソニド，フルチカゾン，ブデゾニドを添加する。感染実験には，SARS-CoV-2の代替として，GFP reporter geneを有しスパイク蛋白を表面に発現する偽型レンチウイルス粒子を用いる。この偽型ウイルス粒子含有液を添加した後，細胞の蛍光鏡検ならびに回収した細胞のフローサイトメトリーにて，偽型ウイルスにより生成される蛍光を評価することで感染ウイルス濃度を定量する。
2．ALI法を用いたSARS-CoV-2の感染経路に関連する分子発現への各種吸入ステロイド薬の影響に関する検討
前項1と同様に，IL-13を含む培地を用いたALI培養において，前項1の各種吸入ステロイド薬を作用させる。その後，メンブレン上の細胞ライセートから抽出したRNAを試料として，ACE2およびTMPRSS2の発現をqRT-PCRにて評価する。
3．その後、ヒトACE2トランスジェニックマウスを用いて，SARS-CoV-2感染性への吸入ステロイド薬の影響を検討することを予定している。
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