緑膿菌肺炎に対する抗体療法による新しい治療法の開発

• Project/Area Number: 24K11658
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 54030:Infectious disease medicine-related
• Research Institution: Oita University
• Principal Investigator: 平松 和史 大分大学, 医学部, 教授 (80301381)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 橋本 武博 大分大学, 医学部, 講師 (70895862)
• Project Period (FY): 2024-04-01 – 2027-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2024)
• Budget Amount: ¥4,550,000 (Direct Cost: ¥3,500,000、Indirect Cost: ¥1,050,000); Fiscal Year 2026: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000); Fiscal Year 2025: ¥1,820,000 (Direct Cost: ¥1,400,000、Indirect Cost: ¥420,000); Fiscal Year 2024: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
• Keywords: 緑膿菌 / 線毛蛋白 / モノクローナル抗体 / 受動免疫 / 肺炎 / 治療

Outline of Research at the Start

緑膿菌は線毛を介して組織侵入などの病原性に関与することが知られており、本研究では緑膿菌線毛蛋白を標的とする抗体療法について緑膿菌肺炎マウスモデルを用いて検討する。精製した緑膿菌線毛蛋白をマウスに免疫し、その脾細胞とNS-1細胞を細胞融合する。得られたハイブリドーマから抗線毛蛋白抗体産生細胞を検索し、目標として50株のハイブリドーマを作成する。これらの抗体を線毛蛋白の認識部位によって分類し、10種類程度の認識部位の異なる抗体を得る予定である。緑膿菌肺炎モデルに得られた抗体を経気道的あるいは腹腔内に投与し、マウスの致死抑制効果やマウス肺内の菌量を測定することで抗体療法の有効性を検証する。

Outline of Annual Research Achievements

抗緑膿菌線毛蛋白モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを作成する最初のステップとして、マウスへ免疫するための緑膿菌線毛蛋白の精製を行った。従来から行っている緑膿菌を大量に培養し、菌を破砕後、サッカロース濃度勾配超遠心法を用いた精製では、線毛蛋白の精製に膨大な労力と時間を要し、その収集量なども不安定であった。そのため、緑膿菌線毛蛋白の精製方法を変更し、His-tagが付加された線毛蛋白を大腸菌に発現させ、高効率に緑膿菌線毛蛋白を精製する系の作成を行った。まず緑膿菌PAO-1株を用いて、線毛蛋白遺伝子pilAをPCR法によって増幅した。PCRに用いたプライマーはpET6xHN Expression Vectorのクローニングサイトに合わせて制限酵素切断部位を導入した。PCR法で増幅したpilAを当初はT-vector pMD19に挿入し、pilAの挿入されたT-vector pMD19（pilA-T-vector）を得た。pilA-T-vectorをプライマーに導入した制限酵素で切断し、pET6xHN Expression VectorのクローニングサイトにpilA遺伝子を挿入した。pilA遺伝子のN末端側（pET6xHN-N）、C末端側（pET6xHN-C）にHis-tagが付加されるベクターがあり、どちらのベクターが線毛蛋白の三次元構造に影響を与えず、且つ効率的に線毛蛋白を抽出できるか不明なため、両方のベクターにpilA遺伝子を挿入した。挿入したプラスミドは大腸菌に導入した。大腸菌に導入したpET6xHN-NおよびpET6xHN-CにpilA遺伝子が挿入されていることをPCR法によって確認した。pilAを導入したpET6xHN-N、pET6xHN-Cについて、設計通りに挿入されているか、塩基配列の決定を行っている。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

計画では、本年度は緑膿菌線毛蛋白の精製を行い、マウスへの免疫、ハイブリドーマの作成を行う予定であった。当初は計画通り、これまで私たちが行っていた寒天平板培地から緑膿菌のコロニーを収集し、菌体を破砕後、サッカロース濃度勾配超遠心法による精製を行った。しかしながら、サッカロース濃度勾配超遠心法による精製において、目的とするバンドが得られる場合と得られない場合があるなど不安定な収集状況であった。そのため想定したような量や精製度の高い線毛蛋白が得られず、研究に遅れが生じた。こうした理由から、緑膿菌線毛蛋白の精製法を変更した。すなわち、His-tagが付加された線毛蛋白を大腸菌内に発現させ、His-tagを用いた蛋白精製を行うことで、より簡便に大量の線毛蛋白を精製できる系の作成を行っている。本年度予定していたマウスへの線毛蛋白を用いた免疫やハイブリドーマの作成などの実験が実施できておらず、研究の進捗はやや遅れていると判断した。

Strategy for Future Research Activity

現在、His-tagが付加されるベクターpET6xHN Expression VectorへのpilA遺伝子の挿入は終了している。今後、このプラスミドを大腸菌へ導入し、大腸菌からHis-tag吸着カラムを用いた発現蛋白の緑膿菌線毛蛋白の精製を行うこととしている。その後、マウスへの免疫やハイブリドーマの作成を行う計画である。His-tagを用いた線毛蛋白の精製法が軌道に乗れば、線毛蛋白の精製が大幅に簡便化でき、研究の遅れを取り戻すことが可能であると考えている。