| Project/Area Number |
24K11790
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 55010:General surgery and pediatric surgery-related
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| Research Institution | Keio University |
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Principal Investigator |
永山 愛子 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 助教 (00573396)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
藏本 純子 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 講師 (60571677)
林田 哲 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 准教授 (80327543)
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| Project Period (FY) |
2024-04-01 – 2029-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2024)
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| Budget Amount *help |
¥4,680,000 (Direct Cost: ¥3,600,000、Indirect Cost: ¥1,080,000)
Fiscal Year 2028: ¥390,000 (Direct Cost: ¥300,000、Indirect Cost: ¥90,000)
Fiscal Year 2027: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000)
Fiscal Year 2026: ¥910,000 (Direct Cost: ¥700,000、Indirect Cost: ¥210,000)
Fiscal Year 2025: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000)
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| Keywords | 乳癌 / 細胞周期 / CDK4/6阻害剤 / SEMA3F |
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| Outline of Research at the Start |
CDK4/6 inhibitors improved survival in advanced breast cancer, however, the tumors eventually acquire resistance. In our previous project, we identified a novel CDK4/6 inhibitor resistant gene, SEMA3F, via the whole-genome CRISPR/Cas9 knockout screen.
SEMA3F is known to function as axon guidance but its role in breast cancer is not clear. Thus, we aim to investigate how SEMA3F confers resistance to CDK4/6 inhibitors. We plan to analyze CDK4/6 kinase activity, cell cycle, apoptosis, cell migration in SEMA3F-ko cells and its correlation with clinical response in patients’samples.
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| Outline of Annual Research Achievements |
我々は先行研究で乳癌細胞株を用い、CRISPR/Cas9による全ゲノムknockout (KO) screen を行い、新たなCDK4/6阻害剤耐性遺伝子の候補であるSEMA3Fを同定した。本研究では、SEMA3Fが乳癌におけるCDK4/6阻害剤耐性にどのように関与しているのか、機能解析や患者検体での評価によって解明することを目的としている。2024年度は下記の実験を行った。
・SEMA3F KO細胞株の樹立とIn vitroでの薬剤耐性の検証：CRISPR/Cas9を用いて、MCF7およびT47DのSEMA3F KOモデルを作成した。ミスマッチ検出アッセイを用いて、電気泳動による切断フラグメントを確認することでSEMA3FのKOが成立していることを確認した。SEMA3F KOモデルにおけるCDK4/6阻害剤の耐性の有無を確認するため、MCF7とT47DでIC50を計測し、palbociclibおよびabemaciclibともにコントロールと比較してKOモデルでのIC50の有意な上昇を認めた。SEMA3FのKOモデル細胞株において、細胞増殖アッセイを行い、palbociclibとの共培養化でコントロールと比較して有意な細胞増殖を確認した。
・乳癌細胞株におけるSEMA3F KOモデルの耐性機序解明を目的とした機能解析：上記のSEMA3F KOモデルを用いて、Palbociclib投与下のサイクリン依存性キナーゼに関連する分子の活性を確認するため、P-Rb, Total Rb, P-Akt, Akt, E2F1, CDK4,Cyclin D1, Cyclin D3, mTORの発現をウェスタンブロッティングを用いて確認した。SEMA3F KOにおいて細胞増殖・細胞周期亢進の表現型を認めた。
・臨床検体での評価：患者検体を用いてCDK4/6阻害剤治療前後のSEMA3F発現と薬剤の有効性との関係性を確認するため、患者12人、治療前後24件のペア検体を対象に、SEMA3F抗体による免疫組織化学染色を行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
我々は先行研究で乳癌細胞株を用い、CRISPR/Cas9による全ゲノムknockout (KO) screen を行い、新たなCDK4/6阻害剤耐性遺伝子の候補であるSEMA3Fを同定した。その後の検証ではsiRNAによるKDモデルを用いてSEMA3FとCDK4/6阻害剤への耐性との関連を示した。本研究においては、KOモデルを作成し、CDK4/6阻害剤耐性のvalidationと機序解明を目的とした機能解析を行う予定となっている。
本年度、MCF7およびT47Dの細胞株を用いたKOモデルの作成に成功し、ミスマッチ検出アッセイによってKO成立を確認した。そうすることによって、siRNAによるKDモデルと異なり、遺伝子機能の完全除去による表現型の確認が可能となった。遺伝子の発現それらのCDK4/6阻害剤に対する耐性の検証を行う実験は計画通りに進展している。患者検体を用いた解析については現在も症例集積を重ねており、来年度以降も継続して解析を行う。
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| Strategy for Future Research Activity |
来年度以降は、樹立したMCF7およびT47DのSEMA3F KO modelを用いて、より詳細な機能解析を予定する。具体的には、細胞周期、apoptosis, migrationを評価し、SEMA3FがKOされることでどのような表現型が確認されるのかを検証する。また、患者検体は集積を継続し、治療の反応性とSEMA3Fの発現との相関について評価を行う。
従来、SEMA3Fは神経細胞の負の軸索誘導因子として同定され、がん組織における機能はいまだに解明されていないことも多い。そのため、SEMA3FをKOすることによって、どのような表現型が特徴的に表れるか、機能解析は探索的な側面もあるため、予定していたものに追加して機能解析を必要とする可能性も考えられる。
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