| Project/Area Number |
24K11856
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 55020:Digestive surgery-related
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| Research Institution | Teikyo University |
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Principal Investigator |
首藤 潔彦 帝京大学, 医学部, 准教授 (90372359)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
山崎 一人 帝京大学, 医学部, 教授 (60302519)
森 幹人 帝京大学, 医学部, 講師 (90399452)
小杉 千弘 帝京大学, 医学部, 准教授 (60375681)
清水 宏明 帝京大学, 医学部, 教授 (80272318)
野島 広之 帝京大学, 医学部, 講師 (10507320)
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| Project Period (FY) |
2024-04-01 – 2027-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2024)
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| Budget Amount *help |
¥4,550,000 (Direct Cost: ¥3,500,000、Indirect Cost: ¥1,050,000)
Fiscal Year 2026: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000)
Fiscal Year 2025: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
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| Keywords | 胃癌 / サルコペニア |
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| Outline of Research at the Start |
サルコペニアの分子メカニズムについては不明な点が多い. 近年, 運動負荷に伴う骨格筋量やマイオカイン産生の増加が癌増殖抑制を担うされ, 関連報告も散見されるようになったが段階的な抗腫瘍効果であることが課題である. 一方でLin28は腫瘍においては正の調節因子であり, 筋組織においては負の調節因子とされている. 本研究はLin28に着目し, 腫瘍の幹細胞能獲得と EM促進, 及び腫瘍関連サルコペニアの背景にあると考えられる抑制型マイクロ RNA とその調節因子といった分子メカニズムを解明し, これらを直接的に制御してサルコペニア担癌患者の予後改善につながる新規治療法を見出すことを目的としている.
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| Outline of Annual Research Achievements |
【研究手法の概要】 2024年度は、(1)消化器癌（食道癌，胃癌，大腸癌）摘出検体のFFPE標本を用いて組織マイクロアレイを作成し，これらにおける腫瘍分化度、増殖能、EMTと、miR-199-3p/Lin28/let-7シグナルの関連、および、臨床病理学的項目との関連を検討した。具体的には免疫組織学的手法を用いて、各腫瘍における腫瘍増殖マーカー（MIB-1），幹細胞マーカー (CD44, SOX2), EMTマーカー（vimentin）、および、LIN28A, LIN28Bの発現を検索し、LIN28A/Bの発現と腫瘍の増殖能，幹細胞能獲得，EMTの性状、および、腫瘍分化度と腫瘍進行期、ステージとの関連を検討した。(2)消化器癌（食道癌，胃癌，大腸癌）の細胞株を用いて、各細胞株におけるLin28A/Bとlet-7の発現をRT-qPCRの手法を用いて解析し，各腫瘍におけるこれらの関連を検討した。
【研究結果の概要】 消化器癌（食道癌，胃癌，大腸癌）における LIN28A/LIN28Bの発現を、非腫瘍部の上皮と腫瘍細胞の染色性を比較して検討した。LIN28Aはいずれの消化器癌においても非腫瘍部と比較して発現の亢進を認めた症例は全体の5%未満で、むしろ腫瘍よりも非腫瘍部における発現レベルが高い傾向が見られた。一方、LIN28Bはいずれの消化器癌においても非腫瘍部と比較して60%以上の症例に発現の亢進を認めた（食道癌 62.5%、胃癌 90.1%, 大腸癌 75.8%）。LIN28Bは高分化型の腫瘍と比較して、中分化・低分化な腫瘍における発現のレベルが高く、vimentinの染色レベルとの間に正の相関を認めた。LIN28Bが腫瘍の発育とEMTに正の因子として作用する可能性が示唆されたが、幹細胞マーカーの発現との関連はみられず、腫瘍進行期、ステージとの間の相関は認めなかった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
【miRNAの検出・定量におけるRT-qPCR法の問題点】
マイクロRNA（miRNA）であるlet7ファミリーは成熟型で22塩基程度の微小なRNAで、定量的に検出するには特殊なRT-PCR法である、stem-loop RT-qPCR法が用いられる。RT-qPCR法によるmiRNAの検出は、逆転写によるcDNAの合成とその後のqPCRによる検出の2段階の反応を経て行われるが、let7ファミリーには互いに1塩基程度の違いしかないような非常に相同性の高いものが複数存在するため、高精度な定量を行うにはこれらの類似したmiRNA を正確に識別することが必要です。しかしながら、個々のmiRNAに特異的なプライマーを設計して安定した定量結果を得ることが困難であった。
逆転写には逆転写用のRTプライマー1種類、qPCR検出にはForwardとReverseの2種類のプライマーが必要となる。これら合計3つのプライマーのうち、既存手法では1つまたは2つのユニバーサルプライマーを用いてきたが、この度、新たに各アイソフォームに応じた特異的なstem-loop構造を有するRTプライマーを設計し、安定したlet7の発現定量が可能となった。このため、今後はLin28/let-7/miR-1シグナルの解析がスムーズに進捗するものと考える。
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| Strategy for Future Research Activity |
消化器癌細胞株と骨格筋芽細胞におけるLin28B, let-7, miR-1の発現をWestern blotting, RT-qPCRの手法を用いて解析し，これらの細胞のベースラインにおけるLin28/let-7/miR-1シグナルの分子メカニズムを解析する。
Lin28A/Bの発現を抑制するとされているmiR-199a-3p，Lin28A/Bのセンス鎖とアンチセンス鎖の合成miRNAを作成し，消化器癌細胞株と骨格筋細胞株に導入する。消化器癌細胞株においては増殖能，幹細胞能獲得，増殖能、遊走・浸潤能が低下するか検証する。骨格筋細胞株については筋分化マーカーの発現量をRT-qPCRで検証する。また，消化器癌細胞株においてはlet-7, 骨格筋細胞株においてはmiR-1の発現量を解析し、miR-199a-3pの導入が癌細胞に対して増殖能，幹細胞能獲得，EMT促進に作用し，筋芽細胞に対して高い分化誘導活性を有するかを検証する。
低分子Lin28阻害剤であるLin28-1632を消化器癌細胞株と骨格筋細胞株に投与し，消化器癌細胞株においては増殖能，幹細胞能獲得，増殖能、遊走・浸潤能が用量依存的に低下するか検証する。骨格筋細胞株についてはLin28-1632の投与によって筋分化マーカーの発現量が用量依存的に上昇するかをRT-qPCRで検証する。Let-7, miR-1の発現についても同様検証する。
腫瘍移植マウスにおいて筋分化誘導剤を構成するmiR-199a-3p，および，Lin28 1632の投与による腫瘍抑制効果について検証する。8週齢のBALB／Cマウスの腹腔に消化器癌細胞株を散布し，隔日にマウスを開腹して腹膜傷害部での腫瘍径を計測する。摘出した播種部よりFFPE切片を作製し，HE染色で病理組織学的検討を観察して薬剤の効果を検証する。
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