| Project/Area Number |
24K11898
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 55020:Digestive surgery-related
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| Research Institution | Jikei University School of Medicine |
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Principal Investigator |
池上 徹 東京慈恵会医科大学, 医学部, 教授 (80432938)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
白井 祥睦 東京慈恵会医科大学, 医学部, 助教 (10785364)
奥井 紀光 鹿児島大学, 医歯学総合研究科, 特任講師 (60648864)
春木 孝一郎 東京慈恵会医科大学, 医学部, 助教 (60720894)
谷合 智彦 東京慈恵会医科大学, 医学部, 助教 (60961860)
古川 賢英 東京慈恵会医科大学, 医学部, 講師 (80624973)
柳垣 充 東京慈恵会医科大学, 医学部, 助教 (80979435)
安田 淳吾 東京慈恵会医科大学, 医学部, 助教 (90896870)
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| Project Period (FY) |
2024-04-01 – 2027-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2024)
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| Budget Amount *help |
¥4,550,000 (Direct Cost: ¥3,500,000、Indirect Cost: ¥1,050,000)
Fiscal Year 2026: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
Fiscal Year 2025: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
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| Keywords | 肝細胞癌 / 癌微小環境 / 癌免疫 |
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| Outline of Research at the Start |
免疫チェックポイント阻害剤の発展に伴い、免疫細胞を含む癌免疫微小環境の理解は未だ予後不良な肝細胞癌の予後改善には必須である。本研究目的は統合ゲノム解析の結果をもとに、TP53/MYC遺伝子関連肝癌細胞株を作製し、形成された腫瘍の同種移植モデルを解析することで高悪性度肝癌の癌免疫微小環境および宿主免疫回避機構を明らかにし、革新的治療の開発につなげることである。
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| Outline of Annual Research Achievements |
肝細胞癌は本邦でも死亡者数が多く、いまだ予後不良とされる癌腫のひとつである。特に高悪性度肝細胞癌に対しては、肝切除や経皮的焼灼療法を中心とした局所療法や従来の化学療法の効果は限定的で、新たな治療戦略の確立が喫緊の課題であった。近年、血管新生阻害剤や免疫チェックポイント阻害剤に代表される癌微小環境を標的とした治療薬の画期的な奏功が報告され、肝細胞癌に対する治療戦略はパラダイムシフトを迎えている。しかし、これらの薬剤による複合免疫療法の奏効率は約30%と限定的であり、どのような癌免疫微小環境を有する肝細胞癌にこれらの薬剤が奏功を示すのか詳細な解明が求められている。統合ゲノム解析による肝細胞癌のサブクラス分類についても国内外から様々な報告があり、非常に注目されている領域である。肝細胞癌においては、P53、TERT、CTNNB1などの特徴的な遺伝子変異が報告され、中でもP53の変異、MYC経路の活性化を特徴とする群は予後不良なサブタイプであることが報告された (EBioMedicine. 2019;40:457-70.)。P53は肝細胞癌において高頻度に変異および不活性化を示すがん抑制遺伝子であり、細胞増殖およびDNA損傷に関与し、MYCは種々の癌で予後不良因子として知られるがん遺伝子の1つであり、肝癌においてもMYCの増幅が造腫瘍性に関与することが報告されている 。以上のようなオミクス解析に基づく肝細胞癌の分子生物学的特徴の解明にくわえ、近年ではオミクス解析と病理学的解析を統合した新たなサブクラス分類が提唱されつつある 。しかし、P53の不活性化およびMYCの活性化を特徴とする高悪性度肝細胞癌の癌免疫微小環境の詳細は明らかにされておらず、依然として予後不良である肝細胞癌において癌免疫微小環境の解明は喫緊の課題である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
Tp53ノックアウト、Myc強制発現のマウス由来肝細胞癌株同種移植モデルの確立。マウス由来の肝細胞癌株にCRISPR/Cas9を用いて、Tp53ノックアウト、Myc強制発現細胞株を作成する。この細胞株をヌードマウスに皮下移植し、増大した腫瘍を摘出後、初代培養を行い、造腫瘍性をもつTp53ノックアウト、Myc強制発現細胞株を樹立する。この細胞株のRNAシークエンスにより、PD-L1の発現がMyc強制発現後に増加していることを確認する。さらに、この細胞株をBL6マウスの皮下移植し、その造腫瘍性を確認、継代する。２）１）で確立したTp53ノックアウト、Myc強制発現のマウス由来肝細胞癌株を使用してwestern blot, PCRにて，Tp53ノックアウト、及びMyc強制発現されていることを確認する。次に、電子顕微鏡にて細胞の形態変化、フローサイトメトリーによる細胞周期、colony formation assayによる幹細胞性、Cell counting kitによる細胞増殖能を評価することで、Mycが腫瘍細胞自体に及ぼす影響について明らかにする。また、Myc強制発現前の細胞株とともにRNAシークエンスに提出することで、Mycがtargetとしている遺伝子について同定する。マウス由来の肝細胞癌株にCRISPR/Cas9を用いて、C57BL6マウス由来の3H3細胞からTp53ノックアウト、Myc強制発現細胞株（3H3PM）を作成した。この細胞株をヌードマウスに皮下移植し、サブクローンを播種して増大した腫瘍を摘出後、初代培養を行い、造腫瘍性をもつTp53ノックアウト、Myc強制発現細胞株を樹立した。これらのサブクローン細胞は非常に核小体が目立ち、異常細胞分裂を行っている病理学的に悪性度の高いものであった
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| Strategy for Future Research Activity |
同定したターゲット遺伝子について、TP53ノックアウト、Myc強制発現肝細胞癌株にさらにノックアウトをおこなう。この細胞株をBL6マウスに皮下移植し、造腫瘍性を確認する。また、免疫チェックポイント阻害剤、血管新生阻害剤、及び併用群での抗腫瘍効果についても評価し、摘出検体の免疫染色で癌微小環境に与える影響についても評価する。以上から同定した遺伝子が造腫瘍性および癌微小環境に及ぼす影響について明らかにする。手術検体の切片を用い、ターゲットの免疫染色を行う。その結果と臨床病理学的背景を併せて、ターゲット遺伝子がどのような臨床病理学的特徴を有するのかを評価する。また、これらのデータを用い多変量解析を行うことで、予後予測因子としての有用性についても検証する。肝細胞癌においては、P53、TERT、CTNNB1などの特徴的な遺伝子変異が報告され、中でもP53の変異、MYC経路の活性化を特徴とする群は予後不良なサブタイプであることが報告された (EBioMedicine. 2019;40:457-70.)。P53は肝細胞癌において高頻度に変異および不活性化を示すがん抑制遺伝子であり、細胞増殖およびDNA損傷に関与し、MYCは種々の癌で予後不良因子として知られるがん遺伝子の1つであり、肝癌においてもMYCの増幅が造腫瘍性に関与することが報告されている 。以上のようなオミクス解析に基づく肝細胞癌の分子生物学的特徴の解明にくわえ、近年ではオミクス解析と病理学的解析を統合した新たなサブクラス分類が提唱されつつある 。しかし、P53の不活性化およびMYCの活性化を特徴とする高悪性度肝細胞癌の癌免疫微小環境の詳細は明らかにされておらず、依然として予後不良である肝細胞癌において癌免疫微小環境の解明は喫緊の課題である。
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