くも膜下出血後の神経炎症に対する間葉系幹細胞由来エクソソームの制御効果

• Project/Area Number: 24K12278
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 56010:Neurosurgery-related
• Research Institution: Hokkaido University
• Principal Investigator: 下田 祐介 北海道大学, 医学研究院, 客員研究員 (60792827)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 川堀 真人 北海道大学, 医学研究院, 講師 (50399870)
• Project Period (FY): 2024-04-01 – 2027-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2024)
• Budget Amount: ¥4,550,000 (Direct Cost: ¥3,500,000、Indirect Cost: ¥1,050,000); Fiscal Year 2026: ¥1,820,000 (Direct Cost: ¥1,400,000、Indirect Cost: ¥420,000); Fiscal Year 2025: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000); Fiscal Year 2024: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
• Keywords: くも膜下出血 / 間葉系幹細胞 / エクソソーム

Outline of Research at the Start

動物SAHモデルに間葉系幹細胞由来の細胞外小胞（エクソソーム）を投与し、脳内炎症（特に白血球とマイクログリア）制御が可能かどうかを以下の2点について検討する
①エクソソームは炎症緩和と機能予後改善が可能か？（Proof of Concept; POC）
②どの生理活性物質（miRNA等）が効果に関与しているのか？（Molecular Mechanism）
本研究はくも膜下出血に特化した研究ではあるが、脳内炎症に対するエクソソームの治療効果およびその機序を解明する重要な実験であり、他の脳内炎症性疾患（脳血管障害急性期・自己免疫性脳疾患）への横展開も可能になるなど広く中枢神経疾患に対する新たな治療法をもたらす可能性のある研究である

Outline of Annual Research Achievements

くも膜下出血モデルの作成とエクソソーム抽出技術の確立を行った。
8週齢の雄スプラーグ・ダウリーラット（CLEA Japan、Inc.）を使用した。麻酔後、頭皮に中央の切開を加え、脳頂点から7.5mm、正中線から1mm右に1mmの穴を開け、大腿静脈より採取した自家血（500 μL）を27Gの眼科用針を用いて前脳頭蓋底に1分間で注入した。これにより死亡率10%以下のモデルが確立した。組織学的に海馬領域のアポトーシス評価、神経脱落評価を行った。またNETs形成の評価のための予備的検討として免疫組織学的検討方法の習得を行った。経動脈内投与と経静脈内投与の両方を試すために実験手技の確立を行った。特に経動脈内投与は頸部の切開と動脈確保がむつかしくかなりの時間を要したが最終的に適切な形で経動脈内投与が可能になったと考えられる
エクソソームの抽出はヒト羊膜由来間葉系幹細胞（AMSC、カネカ）を使用した。細胞は解凍後、1.4 × 10^4細胞/mLの濃度で培地に播種し、3日間培養し、次に、培地を無血清の細胞培養培地（MEMα）に交換し、48時間培養してエクソソームを含む培地上清を得た。エクソソームは超遠心法（100,000×g、70分間）もしくは膜当科処理によって分離した。その後透過型電子顕微鏡（H-7100、日立）およびナノ粒子追跡分析装置（Videodrop、Myriade）、ウェスタンブロット法（CD9、CD63、カルネキシン）の存在を確認した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

今年度は技術確立であり、今のところ過去に報告している方法の踏襲が適切に行われている

Strategy for Future Research Activity

エクソソーム投与によるNETs形成の実験を開始する。