| Project/Area Number |
24K12963
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 57040:Regenerative dentistry and dental engineering-related
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| Research Institution | Health Sciences University of Hokkaido |
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Principal Investigator |
建部 廣明 北海道医療大学, 歯学部, 講師 (40638293)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
志茂 剛 北海道医療大学, 歯学部, 教授 (40362991)
細矢 明宏 北海道医療大学, 歯学部, 教授 (70350824)
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| Project Period (FY) |
2024-04-01 – 2027-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2024)
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| Budget Amount *help |
¥3,640,000 (Direct Cost: ¥2,800,000、Indirect Cost: ¥840,000)
Fiscal Year 2026: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000)
Fiscal Year 2025: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
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| Keywords | 歯根膜 / Sonic hedgehog / α-smooth muscle actin / Osterix / Shh / Gli1 / 遺伝子改変動物実験 |
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| Outline of Research at the Start |
口腔インプラント治療では、インプラント体周囲に十分な骨量が重要である。臨床では人工骨が応用されているが、近年では骨芽細胞分化機構を応用した骨再生の取り組みも行われている。骨芽細胞の分化メカニズムの解明し、骨芽細胞分化因子を同定することにより効率よく骨再生を促すことが可能になる。我々はこれまでの研究で歯根膜幹細胞のGli1陽性細胞が骨芽細胞へ分化することを報告してきた。Gli1の上流因子にSonic hedgehog（Shh）が知られているが、骨芽細胞分化をどのように制御しているかは明らかにされていない。そこで、本研究では、Shh陽性細胞による骨芽細胞の分化制御メカニズムを明らかにする。
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| Outline of Annual Research Achievements |
口腔インプラント治療においては、インプラント体埋入のため、骨補填剤を用いた骨量確保が重要である。近年は骨芽細胞分化機構を応用した骨再生の取り組みも行われている。しかし骨芽細胞分化メカニズムは明らかではない。我々は、これまでSonic hedgehog（Shh）、Gli1が骨折後の骨再生と関連していることを動物実験で示してきた。しかし、骨芽細胞分化過程のどの時期に発現するかについては、明らかにされていない。一方、α-smooth muscle actin（SMA）は細胞骨格タンパクで、血管の周皮細胞や唾液腺の筋上皮細胞などに局在する。近年、α-SMAが、歯槽骨発生過程の早期に未分化の細胞に発現することが報告されている。そこで、本研究では、骨折修復時早期においてもα-SMA陽性細胞が出現するか否かを検証した。本年度は、骨折実験動物モデルを作製し、骨折修復過程の早期にα-SMA陽性細胞が骨折部に局在することを見出した。さらに、一部のα-SMA陽性細胞では骨芽細胞分化マーカーであるrunt-related transcription factor 2（Runx2）、OsterixおよびⅠ型コラーゲンが局在した。これらの結果は、α-SMAが未分化間葉細胞にも発現し、骨芽細胞分化に関係することを示唆している。本実験結果は、第66回歯科基礎医学会学術大会ならびに、論文による発表を行なった。また、8週齢Shh-CreERT2/BMP2fx/fxマウスにタモキシフェンを投与し、Shh陽性細胞のBMP2を枯渇させた。7日後の上顎第一臼歯周囲の歯周組織の非脱灰凍結切片を作製し、Osterix陽性細胞の局在を検討した。野生型マウスと比較すると骨組織の減少ならびにOsterix陽性細胞数の減少を認めた。本研究結果は、Shh陽性細胞によってOsterix発現が調節されていることを示唆している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究では骨芽細胞分化機構の解明することを目的として、歯根膜に存在する未分化間葉細胞の一部が骨芽細胞分化に関連しているか否かを検討した。歯の発生において歯小嚢または歯根膜中では多くの種類の幹細胞が骨芽細胞分化に関わっていると考えられている。我々は、Sonic hedgehog（Shh）とその下流に当たるGli-1について、歯の発生中および骨折後の修復過程において、それらの陽性細胞が出現することを示してきた。本研究では、Shh-Gli1シグナルが歯の発生過程のどの時期に働いているかを検証した。α-Smooth muscle actin (SMA)は歯の発生初期の歯小嚢や歯根膜に局在することが報告されているが、本研究では、α-SMA陽性細胞の発現時期とShhおよび、Gli1陽性細胞の発現時期を比較した。さらに、Shh-CreERT2/BMP2fx/fxマウスを用いて、Shhが骨芽細胞分化過程に必須の因子であることを示した。本年度はShhが骨芽細胞分化過程において重要な因子であることを検証することを目的とした。以上の理由から今年度の実験の進捗状況は概ね順調であると思われる。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後の研究でははGli1因子の上流に位置するShh陽性細胞の動態を検証することが必須である。またShh陽性細胞のBMP2およびBMP4発現を抑制し、Shh陽性細胞の骨芽細胞への分化調節メカニズムを検索する。そこで8週齢Shh-CreERT2/BMPsfx/fxマウスにタモキシフェンを投与し、Shh陽性細胞のBMP2または、BMP4を枯渇させる。次に8週齢Shh-tomatoマウスから臼歯を抜歯し、2 mg/ml collagenase、0.25 % trypsinで37℃、30分間処理することで歯根膜細胞を採取する。FACSを用いtomato蛍光を指標として、Shh陽性細胞を分取する。分取したShh陽性をdishに播種し、幹細胞増殖培地で培養する。これらに0-100 ng/mlのBmp2またはBmp4を添加し、GFP蛍光からOsterix陽性細胞数をカウントする。Shh陽性細胞数が最も増えた培養条件で、Bmp添加前と添加後の細胞群からRNA50μgを抽出し、DNA micro array解析を行う。micro arrayは、（独）産業技術総合研究所の幹細胞研究センターにて解析する。検討はシグナル分子、転写因子に注目し、発現の差から骨芽細胞分化に関わる因子を抽出する。得られた分化促進因子を添加したセルロースを骨欠損部に移植する。マイクロCTの三次元画像および組織切片から歯槽骨量の計測と骨芽細胞の局在の検討の観点から治療効果を評価する。
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