骨肉腫における後期糖化産物受容体（RAGE）を標的とした病態解析と新規治療の開発

• Project/Area Number: 24K19571
• Research Category: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Review Section: Basic Section 56020:Orthopedics-related
• Research Institution: Kanazawa University
• Principal Investigator: 樋口 貴史 金沢大学, 医学系, 協力研究員 (00728719)
• Project Period (FY): 2024-04-01 – 2029-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2024)
• Budget Amount: ¥4,810,000 (Direct Cost: ¥3,700,000、Indirect Cost: ¥1,110,000); Fiscal Year 2028: ¥780,000 (Direct Cost: ¥600,000、Indirect Cost: ¥180,000); Fiscal Year 2027: ¥780,000 (Direct Cost: ¥600,000、Indirect Cost: ¥180,000); Fiscal Year 2026: ¥910,000 (Direct Cost: ¥700,000、Indirect Cost: ¥210,000); Fiscal Year 2025: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000); Fiscal Year 2024: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
• Keywords: 骨肉腫 / RAGE / 後期糖化産物受容体 / 薬剤耐性 / 化学療法

Outline of Research at the Start

我々は骨肉腫において，後期糖化産物受容体（receptor for advanced glycation end-product: RAGE）遺伝子を導入することで，骨肉腫細胞株が幹細胞化し，がん抑制micro-RNAのmiR34aの発現低下、骨肉腫細胞の増殖に関わるWnt5aやcMYCなどの発現亢進を認めることを明らかにし，RAGEが骨肉腫の増殖や転移，がん免疫，微小環境，薬剤耐性に与える影響を解析してきた．本研究では，RAGEの骨肉腫tumorigenesisにおける役割を明らかにし，RAGEを標的とした，骨肉腫の新たな治療戦略の創出へ繋げることを目的とした研究である。

Outline of Annual Research Achievements

令和6年度の研究実績を以下に挙げる。
昨年までに、RAGE高発現マウス骨肉腫細胞（Dunn/RAGE）とそのコントロール骨肉腫細胞（Dunn/mock）を樹立しているが、今回shRNAを用いてRAGEをノックダウンさせた骨肉腫細胞株（Dunn/shRAGE)を樹立予定であったが、手技等の問題で樹立できていない。Dunn/shRAGEを樹立でき次第、その3系統の細胞株において、増殖能、転移能、各種タンパク・RNAの発現解析を行う予定である。さらに、これまでRAGEを高骨肉腫細胞株において、CD133を発現し幹細胞化すること、スフェロイド形成能取得すること、がん抑制miRNA（miR34a）が低下すること、増殖因子（cMYC, WNT5a)が亢進することを明らかにしてきたが、RAGEが骨肉腫細胞を幹細胞化し、悪性度が高まることから、既存の化学療法薬に耐性化する可能性を見出している。そのため、RAGEを阻害することで薬剤耐性解除の可能性を検討するため、RAGE阻害薬である、パパベリン、低分子ヘパリン、ピルビン酸エチル、HMGB1抗体を既存の化学療法薬であるシスプラチンやドキソルビシンに併用してこれらの骨肉腫細胞株に投与することを予定している。これらの薬剤はすでに購入済であり、投与条件等を明確にし、実験の準備を行っているところである。さらに、RAGEを活性化するHMGB1を投与することで、薬剤耐性がより悪化する可能性についても解析し、RAGEと骨肉腫における薬剤耐性の関係を明らかにする予定である。HMGB1 recombinant proteinについては既に購入しており、薬剤条件等を明らかにし、実験する予定である。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

shRNAを用いてRAGEをノックダウンさせた骨肉腫細胞株（Dunn/shRAGE)を樹立予定であったが、手技等の問題で樹立できておらず、その先の実験に進めていない。細胞株が樹立できていないことについては、共同研究者である、金沢大学整形外科学教室の出村諭教授や金沢大学血管分子生物学教室の山本靖彦教授らと適宜協議し、薬剤や条件等の見直しを行い、いつでも再開する準備ができている。また、ノックダウンができ次第、薬剤耐性の解析を行う予定であるが、それらに必要な薬品については購入済であり、現在in vitroで使用する際の条件等を検討中である。
以上より、研究方法の一部を見直し、その解決方法を検討しているが、本研究課題の進捗状況としてはやや遅れていると考えている。

Strategy for Future Research Activity

shRNAによるRAGEのノックダウンについては、薬品や条件について、見直したうえで、再度実験を行う予定である。
RAGEノックダウン株が樹立でき次第、RAGEを阻害するパパベリン、低分子ヘパリン、ピルビン酸エチル、HMGB1抗体を既存の化学療法薬であるシスプラチンやドキソルビシンに併用して、RAGE高発現株、RAGEノックダウン株、Mock株に投与することを予定している。また、これらの細胞株にHMGB1を活性化するHMGB1 recombinant proteinを投与し、薬剤耐性がより亢進するか解析する予定である。RAGE-HMGB1と骨肉腫の薬剤耐性について解析した報告はなく、興味深い結果が得られることを期待している。
in vitroの解析と並行して、in vivoの解析を行う予定である。骨肉腫細胞株をマウスの皮下で増殖させたものを断片化させ、マウスの大腿骨に同所性移植したモデルを樹立する予定である。そのモデルにおいて、まずは転移の自然発生があるかを観察する予定である。この観察については、マウスに苦痛を与えないことを目的に、腫瘍の増大が強い場合は短期間の観察にする、腫瘍を途中で切除するなどの工夫を行う予定で、もし転移が認められない場合は、腫瘍細胞の尾静脈への投与に切り替える可能性も検討している。これらin vivoの解析については、応募者は十分な経験を有しており、マウスを購入し次第、いつでも開始可能と考えている。