| Project/Area Number |
24K23571
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Research Activity Start-up
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Review Section |
0907:Oral science and related fields
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
阿部 未来 北海道大学, 歯学研究院, 専門研究員 (40999603)
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| Project Period (FY) |
2024-07-31 – 2026-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2024)
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| Budget Amount *help |
¥2,860,000 (Direct Cost: ¥2,200,000、Indirect Cost: ¥660,000)
Fiscal Year 2025: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
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| Keywords | 骨芽細胞 / Gli1 / PTH / 軟骨内骨化 / 膜性骨化 |
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| Outline of Research at the Start |
本研究は、長管骨に存在するGli1（hedgehogシグナルの転写因子）陽性を示す未分化間葉系細胞に着目し、軟骨内骨化部位である骨梁と膜性骨化部位である皮質骨における骨芽細胞の分化由来の相違と、これにより、両部位の骨芽細胞がPTHに対して異なる反応性を示す可能性について、モデル動物を用いたin vivo解析を中心にして明らかにする。
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、軟骨内骨化部位（骨梁）と膜性骨化部位（皮質骨）における骨芽細胞の分化由来、および、PTHに対する反応性の相違を明らかにすることを目的としている。本年度では、骨芽細胞の分化において重要なシグナルであるindian hedgehogとその転写因子であるGli1の発現を示す細胞が軟骨内骨化部位（骨梁）と膜性骨化部位（皮質骨）とで分布が異なるのか、また、骨梁と皮質骨とでPTHがIHH/Gli1シグナルを亢進させる程度が異なるのか明らかにすることを主眼においた。
その結果、Gli1-CreErt2マウスとRosa26-loxP-stop-loxP-tdTomatoマウスを交配することで、Gli1陽性細胞の系譜解析が可能なGli1-CreErt2:Rosa26-tdTomatoマウスを作出した。同マウスにタモキシフェンを投与すると、Gli1陽性細胞がtdTomato蛍光蛋白質を発現するため、凍結組織切片を作成して、Gli1陽性細胞の子孫細胞の局在を明らかにした。具体的には、生後8週齢Gli1-CreErt2:Rosa26-tdTomatoマウスにタモキシフェンを２回投与したのち、PTHまたは溶媒（生理食塩水）を連日腹腔内投与し、薬剤投与後、マウス大腿骨における骨幹端骨梁と皮質骨において、Gli1陽性細胞の分布を経時的に観察した。その結果、骨幹端の骨梁部には、Gli1陽性細胞が多数観察され骨梁間を占めていたが、皮質骨にはGli1陽性細胞は認められず、PTH投与後、経時的に観察したところ、Gli1陽性細胞は骨幹端から骨幹方向に向かって、その領域を伸ばしていたが、皮質骨領域からGli1陽性細胞が出現することは無かった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
Gli1-CreErt2マウスとRosa26-loxP-stop-loxP-tdTomatoマウスを交配することで、Gli1陽性細胞の系譜解析が可能なGli1-CreErt2:Rosa26-tdTomatoマウスを作出する時点で、期待通りの遺伝子改変マウスが生まれてくるか否かは技術的に重要と考えられる。研究代表者は、マウスの成長と共に、大腿骨の成長板およびその直下の骨幹端の骨梁にわずかにGli1陽性細胞が観察されるだけなのに対して、PTH投与では成長板と骨幹端に多数のGli1陽性細胞が出現することから、PTHによってIHH/Gli1シグナルの増強の可視化、ならびに、Gli1陽性細胞の増加をin vivoにて明らかにすることができたと考えている。また、その一方で、皮質骨にはGli1陽性細胞が認められないこと、さらには、本研究目的ではないが骨髄間質細胞にはGli1陽性反応が認められなかったことを考慮すると、本研究成果は計画通りに進んでいると思われる。以上、未分化間葉系細胞が骨芽細胞に分化する過程で、Gli1発現が軟骨内骨化領域では誘導されるのに対して、膜性骨化領域では誘導されないこと、また、骨梁と皮質骨の骨芽細胞ではPTHに対するIHH/Gli1シグナルが異なることを明らかにできたことからおおむね順調に進展していると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
PTHを投与すると、長管骨の海綿骨は増加する一方、皮質骨は多孔化(cortical porosity)することが良く知られている。また、研究代表者の学位論文として、皮質骨多孔化は皮質骨への破骨細胞と骨特異的血管の侵入により、多数の血管が皮質骨内部に介在するため、層板骨状の構造ではなく、多孔性の構造を示すと推測した。従って、本研究全体における趣旨は、PTH投与により、骨幹端の骨梁では前骨芽細胞の増殖と骨芽細胞の骨形成が亢進されるのに対して、皮質骨では破骨細胞を伴った血管が皮質骨内部に侵入すること、ならびに、PTH投与による骨梁と皮質骨における組織像の違いの原因は、骨芽細胞分化におけるIHH/Gli1シグナルが骨梁と皮質骨で異なるからなのではないかという推測に基づいている。
従って、次年度の研究では、骨梁領域と皮質骨領域において、破骨細胞誘導因子Rankl, ITAM シグナル(DAP10/12, siglec15, FcRγなど)、血管関連因子(Vegf, Sema3, Hif1a, Vas2, EphB4, Ckap4, Plvap ど)、および、hedgehog 関連因子(Gli1, smoothened, patched など)の遺伝子発現解析を行う予定である。また、Gli1陽性を示さない骨芽細胞系細胞が、破骨細胞や血管内皮細胞・血管周囲細胞などとどのような関連性を示すかについても検索を進める予定である。
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