試験管内増幅法を用いた異常プリオン蛋白質の複製に関与する補因子の探索

• Project/Area Number: 25460575
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Section: 一般
• Research Field: Virology
• Research Institution: National Agriculture and Food Research Organization
• Principal Investigator: 今村 守一 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構, 動物衛生研究部門越境性感染症研究領域, 上級研究員 (10391442)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2016-03-31
• Project Status: Discontinued (Fiscal Year 2015)
• Budget Amount: ¥5,070,000 (Direct Cost: ¥3,900,000、Indirect Cost: ¥1,170,000); Fiscal Year 2015: ¥1,820,000 (Direct Cost: ¥1,400,000、Indirect Cost: ¥420,000); Fiscal Year 2014: ¥1,820,000 (Direct Cost: ¥1,400,000、Indirect Cost: ¥420,000); Fiscal Year 2013: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
• Keywords: プリオン / 異常型プリオン蛋白質 / 構造変換補因子 / PMCA / プリオン病 / 補因子

Outline of Annual Research Achievements

本研究は、正常型プリオン蛋白質(PrPC)から異常型プリオン蛋白質(PrPSc)への構造変換に必要となる補因子を同定し、変換プロセスにおける役割を検討することを目的とした。補因子の探索には、我々が以前構築したバキュロウイルス由来組換えプリオン蛋白質(Bac-PrP)を基質として試験管内でPrPScを増幅する改良protein misfolding cyclic amplification (PMCA)法を用いた。
PrPSc増幅誘導剤であるプロテアーゼK(PK)・熱処理昆虫細胞溶解液を複数の生体分子分解酵素で処理した後、PMCAを行うことで、PrPScの増幅に関わる生体分子の同定を試みた。その結果、ヘパラン硫酸やコンドロイチン硫酸等のグリコサミノグリカンおよびリン脂質、コレステロールがBac-PrPからBac-PrPScへの構造変換に関与することが明らかになった。しかしながら、これらの因子だけでは、PMCAによるBac-PrPScへの変換は誘導されず、さらなる因子が必要であることが示唆された。また、本研究ではPMCAの反応温度を37℃から45℃にあげることで、PrPScシード依存的なBac-PrPScへの構造変換効率が向上し、さらに、PrPScに特徴的な性質であるプロテアーゼ抵抗性を獲得したBac-PrPが自発的に生成することを明らかにした。この結果は高温度条件がBac-PrPの構造に影響することによりPrPScへの構造変換を促進する可能性を示唆してる。

Research Products

• [Journal Article] Multiple-affinity purification of a baculovirusderived recombinant prion protein with in vitro ability to convert to its pathogenic form (2016)
  • Author(s): Morikazu Imamura, Nobuko Kato, Yoshifumi Iwamaru, Shirou Mohri, Takashi Yokoyama, Yuichi Murayama
  • Journal Title: Preparative Biochemistry and Biotechnology Volume: Epub ahead of print Issue: 1 Pages: 1-7
  • DOI: 10.1080/10826068.2016.1155058
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Insect Cell-Derived Cofactors Become Fully Functional after Proteinase K and Heat Treatment for High-Fidelity Amplification of Glycosylphosphatidylinositol-Anchored Recombinant Scrapie and BSE Prion Proteins (2013)
  • Author(s): Morikazu Imamura, Nobuko Kato, Hiroyuki Okada, Miyako Yoshioka, Yoshifumi Iwamaru, Yoshihisa Shimizu, Shirou Mohri, Takashi Yokoyama, Yuichi Murayama
  • Journal Title: PLOS ONE Volume: 8(12) Issue: 12 Pages: e82538-e82538
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0082538
  • Peer Reviewed
• [Presentation] Estimating the risk of transmission of BSE and scrapie to ruminants and humans by protein misfolding cyclic amplification (2015)
  • Author(s): Morikazu Imamura, Naoko Tabeta, Yoshifumi Iwamaru, Yuichi Murayama
  • Organizer: Asian Pacific Prion Symposium (APPS) 2015
  • Place of Presentation: 石川県立音楽堂 （石川県金沢市）
  • Year and Date: 2015-09-04
• [Presentation] Risk estimation of transmission of BSE and scrapie by PMCA (2015)
  • Author(s): Morikazu Imamura, Naoko Tabeta, Yoshifumi Iwamaru, Yuichi Murayama
  • Organizer: Prion 2015
  • Place of Presentation: Colorado, USA
  • Year and Date: 2015-05-26
• [Presentation] Glycosaminoglycans can be used as substitutes for nucleic acids in in vitro amplification of insect cell-derived abnormal form of prion protein (2014)
  • Author(s): 今村守一、加藤伸子、岩丸祥史、横山隆、村山裕一
  • Organizer: Asia Pacific Prion Symposium 2014
  • Place of Presentation: 済州（韓国）
  • Year and Date: 2014-07-06 – 2014-07-07
• [Presentation] グリコサミノグリカンは昆虫細胞由来異常プリオン蛋白質の試験管内増幅における核酸の役割を代替できる (2013)
  • Author(s): 今村守一、加藤紳子、岩丸祥史、横山隆、村山裕一
  • Organizer: 第36回日本分子生物学会年会
  • Place of Presentation: 神戸