創薬開発に向けたウイルススーパーファミリー１ヘリカーゼの構造と機能に関する研究

• Project/Area Number: 25460576
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Section: 一般
• Research Field: Virology
• Research Institution: National Institute of Agrobiological Sciences
• Principal Investigator: 加藤 悦子 国立研究開発法人農業生物資源研究所, 生体分子研究ユニット, 上級研究員 (00355752)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2016-03-31
• Project Status: Discontinued (Fiscal Year 2015)
• Budget Amount: ¥5,200,000 (Direct Cost: ¥4,000,000、Indirect Cost: ¥1,200,000); Fiscal Year 2015: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000); Fiscal Year 2014: ¥2,210,000 (Direct Cost: ¥1,700,000、Indirect Cost: ¥510,000); Fiscal Year 2013: ¥1,820,000 (Direct Cost: ¥1,400,000、Indirect Cost: ¥420,000)
• Keywords: ウイルス / ヘリカーゼ / タンパク質 / SAXS / X線 / ITC / タンパク質構造

Outline of Annual Research Achievements

スーパーファミリ１（SF1）ヘリカーゼは、多くの農学上および獣医学上重要なウイルスにコードされている。しかし、その立体構造や原子レベルでの機能は不明な点が多い。近年、我々はトマトモザイクウイルス（ToMV）がコードするSF1ヘリカーゼの安定領域（ToMV-Hel）を決定し、その立体構造の決定に成功した。同様に、他のウイルスがコードするSF1ヘリカーゼの構造と機能が解明できれば、その共通性や相違点から、ウイルスSF1ヘリカーゼの機能を明らかするとともに、将来的に創薬開発に対しての基盤情報となることが期待できる。
本申請課題では、ToMVと同様にSF1ヘリカーゼをコードする4種類ウイルスについて、i) 発現系の構築、ii) 精製方法の確立、iii) NTPase活性の評価、iv) 結晶化の検討、v) X線溶液散乱(SAXS)実験を行った。E型肝炎および風疹ウイルスのヘリカーゼドメインについては、発現量が少なく精製タンパク質を得ることはできなかった。ベネズエラウマ脳炎ウイルスのヘリカーゼドメインを含むタンパク質（VEEV-nsP2）については、精製タンパク質が効率よく得られた。SAXSによる解析の結果、精製VEEV-nsP2は単分散で良好な溶液状態にあることが分かり、低分解能構造が得た。しかし、本課題終了時点で結晶化条件の検討を継続中である。豚流行性下痢ウイルスのヘリカーゼドメインを含むタンパク質（PEDV-nsp10）についての研究は、大きく進展した。純度の高いタンパク質の精製方法を確立し、VEEV-nsP2と同様にSAXS解析を行った結果、単分散で良好な溶液状態にあることが分かり、低分解能構造が得た。さらに結晶化条件の検討を行い、タンパク質由来の反射を確認した。本課題終了時点では、より分解能の高い結晶を得るため結晶化条件の再検討中である。

Research Products

• [Presentation] ウイルス由来スーパーファミリー1ヘリカーゼのNTP加水分解活性の評価 (2015)
  • Author(s): 福嶋大智,瀬尾和聖,城所俊一,加藤悦子
  • Organizer: 第15回日本蛋白質科学会年会
  • Place of Presentation: あわぎんホール
  • Year and Date: 2015-06-24 – 2015-06-26
• [Presentation] Evaluation for the NTP hydrolysis activity of superfamily 1 viral helicases (2015)
  • Author(s): 福嶋大智,瀬尾和聖,城所俊一,加藤悦子
  • Organizer: The 4th International GIGAKU Conference in Nagaoka
  • Place of Presentation: 長岡技術科学大学
  • Year and Date: 2015-06-19 – 2015-06-21
• [Presentation] プラス鎖RNAウイルスがコードするスーパーファミリー1ヘリカーゼドメインの構造 (2014)
  • Author(s): 加藤悦子, 錦織雅樹, 小林千歩子, 松村浩由, 石川雅之
  • Organizer: 第62回日本ウイルス学会学術集会
  • Place of Presentation: パシフィコ横浜
  • Year and Date: 2014-11-10 – 2014-11-12
• [Book] Peptide Science 2013 (2014)
  • Author(s): Etsuko Katoh, Kazuhiro Ishibashi, Chihoko Kobayashi, Hiroyoshi Matsumura, Masayuki Ishikawa
  • Publisher: The Ｊａｐａｎｅａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ