PCR合成DNAによる革新的な新規遺伝子発現抑制RNAi技術の開発

• Project/Area Number: 25660080
• Research Category: Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Research Field: Applied biochemistry
• Research Institution: Yamaguchi University
• Principal Investigator: 中村 美紀子 山口大学, 大学研究推進機構, 研究員 (20457310)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2016-03-31
• Project Status: Discontinued (Fiscal Year 2015)
• Budget Amount: ¥4,030,000 (Direct Cost: ¥3,100,000、Indirect Cost: ¥930,000); Fiscal Year 2015: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000); Fiscal Year 2014: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000); Fiscal Year 2013: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000)
• Keywords: RNA interference / PCR / 遺伝子ノックダウン / 遺伝子ノックダウン技術 / RNA干渉 / siRNA配列

Outline of Annual Research Achievements

遺伝子機能を解明するため、目的の遺伝子発現のみを抑制するRNA干渉（RNAi)技術が汎用されているが、RNAiに用いられる配列によっては目的の遺伝子発現を完全に抑制させることができないことが多々ある。これは、RNAi配列の設計が経験則に頼っており、未だ理論的な法則が見出されていないために、最適な配列が用いられていないからである。そこで、RNAi配列の法則性を明らかにし、その設計方法の確立を目指した。
まず、安定にRNAi効果を測定できる感度の良い測定方法の確立を目指した。最初はヒト化コドンのルシフェラーゼ遺伝子を用いたが安定な測定方法を確立できなかったので、ヒト化コドン緑色蛍光タンパク質EGFPに変更し、EGFPで安定な測定方法を確立した。次に、RNAi配列の法則性を見出すために様々なEGFPに対するRNAi配列を設計し、PCRでコンストラクトの作製を試みたが、設計したほとんどの配列がPCRで増幅できなかった。そこでPCRによるコンストラクト作製技術の開発をはじめた。DNAポリメラーゼ、PCR条件、コンストラクト（種々のプロモータ、RNAi配列の長さ、ターミネータなど）など、様々な条件を検討し、RNAiコンストラクトをPCRで作製できるようにした。次に、開発したコンストラクト作製技術を用いて様々なRNAi配列を作製し、RNAi効果の検証を行った。その結果、RNAi効果のある配列とない配列を区別することができた。次に、効果のあった配列について１塩基変異を導入しRNAi効果に重要な配列を調べたが、１塩基置換ではRNAi効果は減少しなかった。そこで更なる変異を加えることでRNAi効果に重要な配列を明らかにすることを目指した。他の遺伝子についてもRNAi効果を示す配列を見出すことでRNAi効果を示す配列の法則性を明らかにするため、20種類の候補ヒト遺伝子をクローニングした。

Research Products

• [Journal Article] A Novel Terminator Primer and Enhancer Reagents for Direct Expression of PCR-Amplified Genes in Mammalian Cells. (2015)
  • Author(s): Mikiko Nakamura, Ayako Suzuki, Junko Akada, Tohru Yarimizu, Ryo Iwakiri, Hisashi Hoshida, Rinji Akada
  • Journal Title: Molecular Biotechnology Volume: 印刷中 Issue: 8 Pages: 767-780
  • DOI: 10.1007/s12033-015-9870-5
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Presentation] 思い通りのＤＮＡデザインを目指した遺伝子操作技術と合成生物学 (2015)
  • Author(s): 中村美紀子
  • Organizer: 2015年度日本農芸化学会大会
  • Place of Presentation: 岡山大学
  • Year and Date: 2015-03-26 – 2015-03-29
  • Invited