タバコ煙中低分子化合物による細胞傷害メカニズムの解明と無毒化タバコ作製の試み

• Project/Area Number: 25670123
• Research Category: Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Research Field: General pharmacology
• Research Institution: Hokkaido University
• Principal Investigator: 三輪 聡一 北海道大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (40157706)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2014-03-31
• Project Status: Discontinued (Fiscal Year 2013)
• Budget Amount: ¥3,900,000 (Direct Cost: ¥3,000,000、Indirect Cost: ¥900,000); Fiscal Year 2014: ¥1,950,000 (Direct Cost: ¥1,500,000、Indirect Cost: ¥450,000); Fiscal Year 2013: ¥1,950,000 (Direct Cost: ¥1,500,000、Indirect Cost: ¥450,000)
• Keywords: タバコ煙ガス相 / 不飽和カルボニル化合物 / アクロレイン / メチルビニルケトン / シクロペンテノン / カルボニル化

Research Abstract

我々は、タバコ煙ガス相に含まれる細胞傷害性因子として、不飽和カルボニル化合物であるアクロレイン・メチルビニルケトン・シクロペンテノンの同定に成功した。しかしながら、これらの化合物による細胞傷害の分子機構は不明である。そこで本年度は、不飽和カルボニル化合物による細胞傷害の分子機構の解明に向け、タンパク質のカルボニル化の検出方法の確立を試みた。不飽和カルボニル化合物で処理した細胞から、免疫沈降法によってタンパク質を精製した。精製したタンパク質のカルボニル化の有無を、Aldehyde Reactive Probe（ARP）で検出した。条件検討の結果、免疫沈降にあたっては、細胞の可溶化にNP-40バッファーを用いることで良好な結果が得られることが判明した。この確立した手法を用いてPKC、STIM1、GAPDHなどのタンパク質が不飽和カルボニル化合物によるカルボニル化修飾を受けることを見出した。
不飽和カルボニル化合物による細胞傷害を抑制できる化合物を見出すため、ハイスループットかつ定量的な細胞傷害の評価方法の確立を試みた。細胞膜傷害に伴って細胞内に取り込まれるPropidium iodide（PI）の蛍光を、フローサイトメトリーを用いて評価したところ、不飽和カルボニル化合物の濃度、及び処理時間依存的な反応関係が得られた。本手法は、酸化還元反応等、他の化学反応や酵素反応の影響を殆ど受けなかったことから、不飽和カルボニル化合物による細胞傷害の抑制物質のスクリーニングに適した手法であると考えられる。

Research Products

• [Journal Article] Identification of stable cytotoxic factors in the gas phase extract of cigarette smoke and pharmacological characterization of their cytotoxicity. (2013)
  • Author(s): Noya Y, Seki K, Asano H, Mai Y, Horinouchi T, Higashi T, Terada K, Hatate C, Hoshi A, Nepal P, Horiguchi M, Kuge Y, Miwa S.
  • Journal Title: Toxicology Volume: 314 Issue: 1 Pages: 1-10
  • DOI: 10.1016/j.tox.2013.08.015
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Endothelin receptor signaling: new insight into its regulatory mechanisms (2013)
  • Author(s): Horinouchi T, Terada K, Higash T, Miwa S
  • Journal Title: Journal of Pharmacological Sciences Volume: 123 Pages: 85-101
  • NAID: 130003382599
  • Peer Reviewed
• [Presentation] エンドセリン受容体シグナルソーム形成からみた治療戦略 (2014)
  • Author(s): 堀之内孝広、寺田晃士、東恒仁、星暁壮、三輪聡一
  • Organizer: 第87回日本薬理学会年会
  • Place of Presentation: 東北大学（仙台市）
  • Invited
• [Presentation] ラット骨格筋細胞においてエンドセリン-1により活性化されるシグナル伝達機構の解明 (2014)
  • Author(s): 星暁壮、堀之内孝広、原田拓弥、比嘉綱己、東恒仁、寺田晃士、眞井洋輔、ネパール プラハ、堀口美香、旗手千鶴、三輪聡一
  • Organizer: 第87回日本薬理学会年会
  • Place of Presentation: 仙台国際センター（仙台市）
• [Presentation] ユビキチン化によるエンドセリン受容体の細胞内トラフィキング制御 (2014)
  • Author(s): 三輪聡一、寺田晃士、東恒仁、Nepal Prabha、堀之内孝広
  • Organizer: 第87回日本薬理学会年会
  • Place of Presentation: 仙台国際センター（仙台市）
  • Invited
• [Presentation] エンドセリンB型受容体のトラフィッキングにおける受容体ユビキチン化の役割 (2014)
  • Author(s): 寺田晃士、堀之内孝広、東恒仁、Nepal Prabha、堀口美香、旗手千鶴、星暁壮、眞井洋輔、原田拓弥、三輪聡一
  • Organizer: 第87回日本薬理学会年会
  • Place of Presentation: 仙台国際センター（仙台市）
• [Presentation] タバコ煙ガス相中の細胞傷害成分の同定と細胞傷害メカニズムの解析 (2014)
  • Author(s): 東恒仁、眞井洋輔、堀之内孝広、寺田晃士、星暁壮、堀口美香、Prabha Nepal、原田拓弥、旗手千鶴、三輪聡一
  • Organizer: 第87回日本薬理学会年会
  • Place of Presentation: 仙台国際センター（仙台市）
• [Presentation] エンドセリン-1による骨格筋インスリン・シグナルの抑制性制御機構の解明 (2013)
  • Author(s): 原田拓弥、堀之内孝広、東恒仁、寺田晃士、比嘉綱己、眞井洋輔、星暁壮、Nepal Prabha、堀口美香、旗手千鶴、三輪聡一
  • Organizer: 第27回北海道薬物作用談話会
  • Place of Presentation: 酪農学園大学（江別市）
• [Presentation] Ubiquitin modification plays an important role in ET-1-dependent endothelin type B receptor signaling (2013)
  • Author(s): 寺田晃士
  • Organizer: 13th International Conference on Endothelin
  • Place of Presentation: 筑波大学東京キャンパス（東京）
• [Presentation] Negative regulation of endothelin type A receptor-operated TRPC6 channel by adenylate cyclase-cAMP-protein kinase A signaling pathway (2013)
  • Author(s): 堀之内孝広
  • Organizer: 13th International Conference on Endothelin
  • Place of Presentation: 筑波大学東京キャンパス（東京）
• [Presentation] Endothelin-1 activates extracelllar signal-regulated kinases 1 and 2 through transactivation of platelet-derived growth factor receptor in skeletal muscle cells (2013)
  • Author(s): 東恒仁
  • Organizer: 13th International Conference on Endothelin
  • Place of Presentation: 筑波大学東京キャンパス（東京）
• [Presentation] Molecular mechanism for suppression of insulin signaling by endothelin-1 in skeletal muscle cells (2013)
  • Author(s): 堀之内孝広
  • Organizer: 13th International Conference on Endothelin
  • Place of Presentation: 筑波大学東京キャンパス（東京）
• [Presentation] エンドセリンB型受容体のET-1刺激誘発的な細胞内移行とシグナルの制御におけるユビキチン修飾の役割 (2013)
  • Author(s): 寺田晃士、堀之内孝広、東恒仁、Nepal Prabha、堀口美香、旗手千鶴、星暁壮、三輪聡一
  • Organizer: 第64回日本薬理学会北部会
  • Place of Presentation: 大雪クリスタルホール（旭川市）
• [Presentation] 骨格筋細胞におけるエンドセリン受容体を介したインスリン・シグナリングの抑制性制御機構の解明 (2013)
  • Author(s): 堀之内孝広、原田拓弥、東恒仁、寺田晃士、比嘉綱己、眞井洋輔、星暁壮、Nepal Prabha、堀口美香、旗手千鶴、三輪聡一
  • Organizer: 第64回日本薬理学会北部会
  • Place of Presentation: 大雪クリスタルホール（旭川市）
• [Presentation] ニコチン及びタール除去タバコ煙抽出物に含まれる細胞傷害因子の性状解析 (2013)
  • Author(s): 東恒仁、眞井洋輔、堀之内孝広、寺田晃士、旗手千鶴、星暁壮、Prabha Nepal、堀口美香、三輪聡一
  • Organizer: 第64回日本薬理学会北部会
  • Place of Presentation: 大雪クリスタルホール（旭川市）
• [Presentation] エンドセリン-1によるインスリン-Aktシグナル伝達の抑制性制御におけるGタンパク質共役型受容体キナーゼ2の関与 (2013)
  • Author(s): 堀之内孝広、原田拓弥、星暁壮、東恒仁、寺田晃士、比嘉綱己、眞井洋輔、Nepal Prabha、堀口美香、旗手千鶴、三輪聡一
  • Organizer: 第23回日本循環薬理学会
  • Place of Presentation: 福岡大学（福岡市）