微小変化型ネフローゼ症候群におけるDNAメチル化を指標とした病態診断法の開発

• Project/Area Number: 25670265
• Research Category: Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Research Field: Laboratory medicine
• Research Institution: Gunma University
• Principal Investigator: 渡部 登志雄 群馬大学, 医学部附属病院, 講師 (70375575)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 小林 靖子 群馬大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (60451720)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2015-03-31
• Project Status: Discontinued (Fiscal Year 2014)
• Budget Amount: ¥3,900,000 (Direct Cost: ¥3,000,000、Indirect Cost: ¥900,000); Fiscal Year 2015: ¥910,000 (Direct Cost: ¥700,000、Indirect Cost: ¥210,000); Fiscal Year 2014: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000); Fiscal Year 2013: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
• Keywords: ネフローゼ症候群 / ＤＮＡメチル化 / 病態診断 / DNAメチル化

Outline of Annual Research Achievements

微小変化型ネフローゼ症候群（ＭＣＮＳ）は小児ネフローゼ患者の約７５％を占める主要な疾患であるが、大量の蛋白尿を呈するほかには病態・症状の変化をとらえることのできるマーカーは知られていない。本研究では研究者のグループが同定したＭＣＮＳ患者の病態の変化と相関してＤＮＡメチル化が変化する遺伝子８２種のDNAメチル化を指標としてMCNS患者の病態診断法を確立することを目標とする。
検体の採取：本研究では蛋白尿を呈する再発期、治療により蛋白尿が消失した寛解期、および年齢・性別を一致させた健常ボランティア末梢血から単核細胞（ＰＢＭＣ）を分離後、ナイーブＴ細胞を抗体磁気ビーズ法で分取しそのＤＮＡのメチル化の変化をメチル化感受性制限酵素処理・定量ＰＣＲ法によって解析する。再発時のサンプルを9患者分、寛解期２患者分のＰＢＭＣを採取・保存した。
メチル化感受性制限酵素HpaII法によるDNAメチル化率の検出:８２遺伝子のうちＩＰＡ解析の結果、オントロジー解析、パスウェイ解析などの結果を総合して１２の遺伝子をターゲット遺伝子として選定した。ＭＩＡＭＩ法で用いたプローブを挟む上流・下流2か所のHapaII制限酵素サイト（CCGG)を挟む形で、メチル化検出プライマーを設計した。またHapaII制限酵素サイトの手前に、コントロールプライマーを設定した。
CpGノンメチルＪｕｒｋａｔ　ＤＮＡをよび完全メチル化ＤＮＡを混合し、０－100%メチル化ＤＮＡを調整した。HpaII およびＭｓｐＩで完全消化し、設計したメチル化検出プライマーおよびコントロールプライマーを用いて定量ＰＣＲを行った。結果、プライマーにより、ＤＮＡのメチル化をよく反映するものもあるが、ほぼ増幅に変化がみられないものもあった。　今後診断に用いるためには、より慎重にプライマーの設計を行ってゆく必要があることが分かった。

Research Products

• [Presentation] 小児免疫疾患・生活習慣病におけるゲノム・エピゲノム解析による病因・病態の解明
  • Author(s): 小林靖子
  • Organizer: ゲノム・エピゲノム解析による生活習慣病の病態解明とその制御を目指した分子標的の探索研究プロジェクト キックオフシンポジウム
  • Place of Presentation: 群馬大学・生体調節研究所