ブタ脂肪前駆細胞におけるゲノム編集を用いた細胞分化制御メカニズムの解析

• Project/Area Number: 26450454
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Section: 一般
• Research Field: Integrative animal science
• Research Institution: National Institute of Agrobiological Sciences
• Principal Investigator: 渡部 聡 独立行政法人農業生物資源研究所, その他部局等, 主任研究員 (80391572)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2015-03-31
• Project Status: Discontinued (Fiscal Year 2014)
• Budget Amount: ¥5,070,000 (Direct Cost: ¥3,900,000、Indirect Cost: ¥1,170,000); Fiscal Year 2016: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000); Fiscal Year 2015: ¥1,820,000 (Direct Cost: ¥1,400,000、Indirect Cost: ¥420,000); Fiscal Year 2014: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
• Keywords: ゲノム編集 / EndoGalC / target toxin / 細胞選択法

Outline of Annual Research Achievements

近年、ゲノム編集技術が開発され、遺伝子改変を容易に行うことが可能になった。しかし、従来のノックアウト法とは異なりゲノム編集では薬剤耐性遺伝子を用いないため、遺伝子改変が起こった細胞を選択するために多大な手間と時間を要していた。そのため効率の良い新たな選択方法が求められていた。
一方、新世界ザルより下等な生物は全て細胞表面にαGal抗原(Galα1-3Gal-R)という糖鎖構造を持つ。この糖鎖構造はBS-IB4というレクチンによって特異的に認識される。また、このレクチンにタンパク合成を阻害する毒素であるサポリンを結合させたIB4-SAPを動物細胞に作用させると、この物質が結合した細胞に細胞死を起こす。その濃度は0.4-1.0 μg/mlと極めて低濃度であり処理時間も30分間で十分である。また、Endo-β-galactosidase C (EndoGalC)はウェルシュ菌から単離されαGal抗原を特異的に切断する酵素である。この酵素遺伝子を動物細胞で発現させると細胞表面のαGal抗原を除去することができ、IB4-SAP処理による細胞死を回避できる。
そこで、EndoGalC発現ベクターをhCas9発現ベクター、gRNA発現ベクターと細胞に共導入し、IB4-SAP処理を行うことで遺伝子改変細胞を濃縮する方法を開発した。これまでに、ブタ胎児繊維芽細胞、ブタ脂肪前駆細胞、マウス繊維芽細胞、マウスES細胞など、生物・細胞種を問わず遺伝子改変細胞の濃縮が確認でき、単離された細胞の約10％がbi-allelicなノックアウトであることが確認された。これらより、EndoGalCとIB4-SAPの組み合わせはCRISPRにおける遺伝子改変細胞の濃縮方法として非常に有効であることが示された。

Research Products

• [Journal Article] A non-inheritable maternal Cas9-based multiple-gene editing system in mice (2016)
  • Author(s): Sakurai T, Kamiyoshi A, Kawate H, Mori C, Watanabe S, Tanaka M, Uetake R, Sato M, Shindo T.
  • Journal Title: Sci Rep Volume: 6 Issue: 1 Pages: 20011-20011
  • DOI: 10.1038/srep20011
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Generation of α-1,3-galactosyltransferase-deficient porcine embryonic fibroblasts by CRISPR/Cas9-mediated knock-in of a small mutated sequence and a targeted toxin-based selection system. (2015)
  • Author(s): Sato M, Kagoshima A, Saitoh I, Inada E, Miyoshi K, Ohtsuka M, Nakamura S, Sakurai T, Watanabe S
  • Journal Title: Domestic Animal Reproduction Volume: 50 Issue: 5 Pages: 872-880
  • DOI: 10.1111/rda.12565
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] A combination of targeted toxin technology and the piggyBac-mediated gene transfer system enables efficient isolation of stable transfectants in nonhuman mammalian cells (2015)
  • Author(s): Sato M, Inada E, Saitoh I, Matsumoto Y, Ohtsuka M, Miura H, Nakamura S, Sakurai T, Watanabe S
  • Journal Title: Biotechnolgy Journal Volume: 10 Issue: 1 Pages: 143-153
  • DOI: 10.1002/biot.201400283
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Direct injection of CRISPR/Cas9-related mRNA into cytoplasm of parthenogenetically activated porcine oocytes causes frequent mosaicism for indel mutations. (2015)
  • Author(s): Sato M, Koriyama M, Watanabe S, Ohtsuka M, Sakurai T, Inada E, Saitoh I, Nakamura S, Miyoshi K
  • Journal Title: International Journal of Molecular Sciences, Volume: 16 Issue: 8 Pages: 17838-17856
  • DOI: 10.3390/ijms160817838
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Presentation] EndGalCとIB4-SAPの組み合わせを用いたCRISPR遺伝子による遺伝子改変細胞濃縮法の開発 (2014)
  • Author(s): 渡部 聡、桜井敬之、中村伸吾、梶原景正、木村 穣、佐藤正宏
  • Organizer: 第37回日本分子生物学会年会
  • Place of Presentation: パシフィコ横浜
  • Year and Date: 2014-11-25