ショウジョウバエを用いたヘパラン硫酸プロテオグリカン結合蛋白質の網羅的解析
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26650041
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Research Field |
Functional biochemistry
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| Research Institution | Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science |
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Principal Investigator |
三枝 智香 公益財団法人東京都医学総合研究所, 脳発達・神経再生研究分野, 研究員 (00280800)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
前田 信明 公益財団法人東京都医学総合研究所, 脳発達・神経再生研究分野, プロジェクトリーダー (90202308)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2018-03-31
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| Project Status |
Discontinued (Fiscal Year 2016)
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| Budget Amount *help |
¥3,900,000 (Direct Cost: ¥3,000,000、Indirect Cost: ¥900,000)
Fiscal Year 2016: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
Fiscal Year 2015: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
Fiscal Year 2014: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
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| Keywords | ヘパラン硫酸プロテオグリカン / ショウジョウバエ / 神経筋接合部 / 神経栄養因子 / タンパク質間相互作用 / エンドサイトーシス / 質量分析 / プロテオーム |
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| Outline of Annual Research Achievements |
前年度までに同定したヘパラン硫酸プロテオグリカン(HSPG)結合タンパク質群の中から、神経栄養因子であるSpatzle(Spz)に焦点を絞り、SpzとHSPGとの結合様式の解析およびショウジョウバエ神経筋接合部における機能解析を行った。
GPIアンカー型HSPGであるDally-like (Dlp)もしくは膜貫通型HSPGであるSyndecan(Sdc)発現ベクターをSpz発現ベクターと共にシュナイダー細胞に導入し、免疫沈降実験を行ったところ、SpzはDlpと特異的に共沈し、Sdcとの共沈はほとんど認められなかった。このことからSpzはDlpと特異的に結合することが示唆された。次にSpz変異体、Dlp変異体の3齢幼虫神経筋接合部を解析したところ、シナプティックブトンの過形成という共通の表現型が認められた。さらにシナプス後部筋肉特異的にspzとdlpの二重ノックダウン個体を作製したところ、spzやdlpの単独ノックダウン個体と比較して、神経筋接合部のブトン数が相乗的に増加した。このことから、spzとdlpとの間には遺伝学的相互作用が認められ、両者は共同でシナプス形成を制御することが示唆された。
またdlpをノックダウンすることで、筋肉やシナプス周辺のSpz-GFPが増加したことから、DlpはSpzの代謝を調節していると考えられる。さらに シュナイダー細胞に発現させたSpzと受容体TollのエンドサイトーシスをDlpが顕著に促進することが分かった。
以上のことから、Dlpは神経筋接合部においてSpzと受容体Tollの経路を修飾することでシナプス形成を調節する、という新規メカニズムが示唆された。また、これにより本研究で確立したHSPG結合タンパク質同定のための実験系の有用性を示すことができた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
前年度までに同定したHSPG結合タンパク質候補群の中から、ショウジョウバエ神経栄養因子Spzに焦点を絞り、詳細な解析を行った。生化学的解析や遺伝学的解析により、SpzとGPIアンカー型HSPGであるDlpとが特異的に相互作用し、両者の相互作用が神経筋接合部のシナプス形成に重要であることを明らかにした。
以上、本研究により同定したHSPG結合タンパク質が生理的に重要であることを示す実験結果を得ており、新規のHSPG結合タンパク質の同定および解析は順調に進んでいると考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
ショウジョウバエ由来培養細胞を用いた実験から、DlpがSpz-Tollの相互作用およびそれに続くエンドサイトーシスを促進すること示す結果を得ている。今後は、「ショウジョウバエ神経筋接合部シナプス形成においてもSpzとTollのエンドサイトーシスをDlpが促進する」という仮説の検証実験を行い、これまでに得られた成果をまとめて学会や論文で発表する。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
培養細胞で得られた実験結果から、「ヘパラン硫酸プロテオグリカンが神経栄養因子SpzとToll受容体の相互作用およびそれに続くエンドサイトーシスを促進する」という結果を得ている。さらにショウジョウバエ個体を用いて同様の結果が得られるかどうか、最終確認の実験を行い、その成果をまとめて学会および論文で発表する。
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Report
(3 results)
Research Products
(2 results)
