精細管再構成によるin vitro精子形成法の開発

• Project/Area Number: 26713049
• Research Category: Grant-in-Aid for Young Scientists (A)
• Allocation Type: Partial Multi-year Fund
• Research Field: Urology
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 奥田 英伸 大阪大学, 医学系研究科, 特別研究員(PD) (00625452)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2017-03-31
• Project Status: Declined (Fiscal Year 2016)
• Budget Amount: ¥5,200,000 (Direct Cost: ¥4,000,000、Indirect Cost: ¥1,200,000); Fiscal Year 2015: ¥2,340,000 (Direct Cost: ¥1,800,000、Indirect Cost: ¥540,000); Fiscal Year 2014: ¥2,860,000 (Direct Cost: ¥2,200,000、Indirect Cost: ¥660,000)
• Keywords: Sertoli-like cells / レンチウイルス / Germline stem cells / 精子形成 / セルトリ細胞 / 遺伝子導入

Outline of Annual Research Achievements

1.Germline stem cell及びieSC(induced embryonic Sertoli cells)、MSC (Mesenchymal Stem cells)の樹立：C57BL6/Tg14(act-EGFP-OsbY01)を購入し、DBA/1Jマウスと交配させ、第一世代のmale pup(日齢１－３)の精巣よりGFP発現GS細胞株を樹立した。MEF(マウス胎児由来繊維芽細胞)を交配後13.5日の妊娠マウス（CBA/J）より樹立し、ieSC作成に不可欠な5因子の遺伝子群（Wt1, Dmrt1, Nr5a, Gata4, Sox9）をレンチウイルス感染により導入した。その後ピューロマイシンによる薬剤選択を行ったのち、クローニングを行った。24 colonyを取り、それぞれの導入遺伝子の発現を確認した。導入遺伝子の発現レベルは個々により非常に大きな差が見られた。その中で比較的発現の高いコロニーを3つ選び出した。これらは非常に高い増殖能を持ち、GDNFとFGFもMEFに比べて亢進しているという点でembryonic Sertoli cellの特長に類似していた。またadultマウスの側腹部の脂肪組織よりMSCを分離・培養を行った。
2.ieSCとGS細胞の共培養：GS細胞の培養にはFeeder cellとFGFとGDNFの添加が必須である。FGF・GDNFの発現をしているieSCをfeederとして培養が可能かどうかを検討した。ieSCをfeederとしてサイトカインなしでGS細胞と共培養を行った。通常GS細胞は増殖をすることができず死滅するが、ieSCをfeederとして使用すると、増殖までは認めなかったが、GS細胞の維持期間がやや延長した。
3.ieSCsを中心としたin vitroの精細管再構成の検討：Satoらが構築したin vitroの精細管再構成法を参考にして、アガロース上にてieSC、MSC、GS細胞の混合したものを培養した。様々な培養条件を検討したが、明らかな精細管の再構成は認められなかった。またGFPを発現するGS細胞も維持できていないことが分かった。

Research Progress Status

27年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

27年度が最終年度であるため、記入しない。

Expenditure Plan for Carryover Budget

27年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Journal Article] A novel transcriptional factor nkapl is a germ cell-specific suppressor of notch signaling and is indispensable for spermatogenesis. (2015)
  • Author(s): Okuda, H., Kiuchi, H., Takao, T., Miyagawa, Y., Tsujimura, A., Nonomura, N., Miyata, H., Okabe, M., Ikawa, M., Kawakami, Y., et al.
  • Journal Title: PLoS ONE Volume: 4 Issue: 4 Pages: e0124293-e0124293
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0124293
  • NAID: 120006957411
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] LRGUK-1 is required for basal body and manchette function during spermatogenesis and male fertility. (2015)
  • Author(s): 2.Liu Y, DeBoer K, de Kretser DM, O’Donnel L, O’Connor AE, Merriner DJ, Okuda, H, Whittle B, Jans D, Efthymiadis A, MacLachlan RI, Ormandy CJ, Goodnow CC, Jamsai D, O’Bryan MK
  • Journal Title: PLoS Genetics Volume: 11(3) Issue: 3 Pages: e1005090-e1005090
  • DOI: 10.1371/journal.pgen.1005090
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] “A novel transcription factor NKAPL is a germ cell-specific suppressor of the Notch signaling pathway and is indispensable for spermatogenesis” (2015)
  • Author(s): Hidenobu Okuda
  • Organizer: The Annual scientific meeting of the Society for the Reproductive Biology in Adelaide
  • Place of Presentation: Adelaide(Austraｌia）
  • Year and Date: 2015-08-22
  • Int'l Joint Research