トマト黄化えそウイルス各種タンパク質の相互作用様式解明

• Project/Area Number: 26870162
• Research Category: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Research Field: Structural biochemistry; Plant protection science
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 薦田 圭介 東京大学, 農学生命科学研究科, 特任助教 (40581640)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2015-03-31
• Project Status: Discontinued (Fiscal Year 2014)
• Budget Amount: ¥4,030,000 (Direct Cost: ¥3,100,000、Indirect Cost: ¥930,000); Fiscal Year 2016: ¥910,000 (Direct Cost: ¥700,000、Indirect Cost: ¥210,000); Fiscal Year 2015: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000); Fiscal Year 2014: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
• Keywords: 構造解析 / TSWV / Nタンパク質 / Lタンパク質

Outline of Annual Research Achievements

本年度は，トマト黄化えそウイルス (TSWV) がコードする各タンパク質の内，RNAポリメラーゼ（Lタンパク質），細胞間移行蛋白質（NSm)，およびサイレンシングサプレッサータンパク質（NSs）に関して，大腸菌を用いた発現系の構築を行った．TSWVのLタンパク質は，330kDaと非常に巨大であり，全長では発現させることが不可能であった．そこで，Lタンパク質のORFを4分割し，それぞれの領域の発現を試みた．結果的に，いくつかの領域で発現が確認されたものの，いずれも不溶性画分に分画されてしまった．今後，さらに細かい領域に分割し，可溶性タンパク質として発現可能な領域を探索する必要がある．NSmタンパク質に関しては，35kDaと比較的小さいタンパク質であるため，全長で発現可能であると思われたが，残念ながら大部分が不溶性画分へと分画されてしまった．そのため，このNSmタンパク質についても，可溶性タンパク質として発現される領域を探索する必要がある．一方，NSsタンパク質に関しては，ヒスタグ・チオレドキシンタグを融合させることで，可溶性タンパク質として発現させることに成功した．その後，ニッケルレジンによる精製，ゲル濾過クロマトグラフィーによる精製にも成功し，純度の高いNSsタンパク質を大量に精製することが出来た．5mg/mLのタンパク質濃度で結晶化を試みたが，現在のところ，X線構造解析が可能な良質の結晶は得られていない．今後，精製条件や結晶化条件の詳細な検討を行う必要がある．

Research Products

• [Journal Article] Possible involvement of eEF1A in Tomato spotted wilt virus RNA synthesis (2014)
  • Author(s): Keisuke Komoda, Kazuhiro Ishibashi, Kazue Kawamura-Nagaya, Masayuki Ishikawa
  • Journal Title: Virology Volume: 468-470 Pages: 81-87
  • DOI: 10.1016/j.virol.2014.07.053
  • Peer Reviewed