動物細胞リボゾームRNAのin vitroプロセシング系の確立

• Project/Area Number: 60214013
• Research Category: Grant-in-Aid for Special Project Research
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Institution: Niigata University
• Principal Investigator: 緒方 規矩雄 新潟大学, 医, 教授 (00018285)
• Project Period (FY): 1985
• Project Status: Completed (Fiscal Year 1985)
• Budget Amount: ¥1,100,000 (Direct Cost: ¥1,100,000); Fiscal Year 1985: ¥1,100,000 (Direct Cost: ¥1,100,000)
• Keywords: rRNA / プロセシング / ヌクレアーゼBal31 / パルス・チェイス実験

Research Abstract

1マウスrRNAのin vitro転写と共役したプロセシング系に用いる鋳型DNAとして、rRNA合成開始点近傍のDNA断片と18S rRNAの5′末端を含むDNA断片を結合した数種類のミニ・ジーンを作成した。パルス・チェイス実験及びS1ヌクレアーゼ保護マッピング法による解析から、この系では18S rRNAの5′末端105塩基上流でプロセシングが生じることが明らかとなった。このin vitroで見い出されたプロセシング部位が、in vivo rRNAのプロセシングにも存在することが確認された。
2プロセシングシグナルとなる流基配列を、DNA塩基から求めるため、プロセシング部位(+1)を中心に欠失変異DNAを、制限酵素切断、ヌクレアーゼBal31を用いて作成した。5′側欠失変異DNAとして-219〜-126,-219〜-55を欠失したもの2個,3′側欠失変異DNAとして+260から-24,+3,+26,+87まで欠失したもの4個を、パルス・チェイス法によりプロセシングの有無を調べた結果、この部位のプロセシングには少なくとも-219から+26の領域の塩基配列が必要であることが判明した。
3プロセシングに関与する因子の存在を調べるため、マウスFM3A細胞から調製したS100(10万×g上流画分)をリン酸セルロースカラムクロマトグラフィーにより、0.1M,0.3M,0.6M,1.0MKCl溶出分画(A,B,C,Dと命名)に分けた。転写開始に必要な因子は、CとDの2分画に存在するが、このプロセシングに関与する因子はA分画に存在することが明らかとなった。このマウス由来のA分画は、ヒト由来のA又はB分画とは交換不可能であり、この部位のプロセシングは、種特異性があることが示唆された。又、A分画を30℃又は45℃,10分間前処理を行ってもプロセシング活性は存在するが、60℃,10分間の処理で活性が失われることから、このプロセシング因子は蛋白性であることが示唆された。

Research Products

• [Publications] EMBO J.4-13B. (1985)