モノクローナル抗体による神経成長因子受容体機能の研究

Research Project

Project/Area Number	60226015
Research Category	Grant-in-Aid for Special Project Research
Allocation Type	Single-year Grants
Research Institution	佐賀医科大学
Principal Investigator	小池達郎佐賀医科大学, 医, 教授 (80128131)
Project Period (FY)	1985
Project Status	Completed (Fiscal Year 1985)
Budget Amount *help	¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,300,000) Fiscal Year 1985: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,300,000)
Keywords	神経成長因子 / 受容体 / 上頚神経節 / フェオクロモサイトーマ / アフィニティー・クロマトグラフィー / レクチン / HPLC
Research Abstract	神経成長因子(NGF)は交感神経節及び知覚神経節を含む神経冠由来の細胞の成長、発育、分化を調節しているタンパク質である。NGFは細胞表層にある特異的受容体(NGF・R)との結合によりその作用を細胞内に伝え、分化した形質の発現を調節していると考えられる。NGF作用機構の解明にはまずNGF・Rの役割を明らかにする必要があると考え1.受容体の再構成と精製の試み及び2.モノクローナル抗体の作成を行った。1.受容体の再構成と精製の試み。上頚神経節を用いてポリエチレングリコールにより膜分画と3T3細胞を融合させると、RI標識した膜及びNGF結合活性の測定から15-35%の膜が取り込まれることが明らかになった。125I-NGFとの結合は飽和性であり、NGFの結合をモュレートするWGLを加えるとNGFの結合量は約80%増加し、さらに高親和性成分の割合も増加した。膜分画を可溶化した後NGFアフィニティークロマトグラフィーで部分精製した成分をリン脂質膜に組み込むと、NGFとの結合から高い親和性(Kd0.28nM)と低い親和性(Kd3.2nM)の2つのサイトを再現できた。WGLは高い親和性部位を増加せしめた。この再構成膜をさらに3T3細胞に植え込むこともできた。膜可溶化成分を高速液クロ(HPLC)で分析すると2つの成分が結合活性を示した、ハイドロキシアパタイトや陰イオン交換クロマトでは失活が激しく、ゲルロ過とアフィニティークロマトグラフィーのみがかなり精製されたNGF・Rを与えた。2.モノクローナル抗体作成。この様に部分精製したNGF・R成分を用いてin vitro immunization法によりモノクローナル抗体を作成した、現在ELISA法によって、ハイブリドーマのアッセィを行っている。さらに抗体の生理的作用についても調べる予定でいる。