| Project/Area Number |
61015063
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Cancer Research
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Research Institution | Kobe University |
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Principal Investigator |
藤原 美定 神戸大, 医学部, 教授 (70030848)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
松本 明 神戸大学, 医学部, 助手 (80181759)
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| Project Period (FY) |
1986
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| Project Status |
Completed (Fiscal Year 1986)
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| Budget Amount *help |
¥2,600,000 (Direct Cost: ¥2,600,000)
Fiscal Year 1986: ¥2,600,000 (Direct Cost: ¥2,600,000)
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| Keywords | 色素性乾皮症 / UV抵抗性形質転換 / DNA導入 / cDNA / A群遺伝子 / DNA修復 / 除去修復 |
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| Research Abstract |
高発癌性色素性乾皮症(XP)には9遺伝子相補群があり、共通して除去修復初期段階活性を欠損する。日本で発症頻度と発癌性の最も高いA群遺伝子をクローニングすることが重要である。ゲノムDNA導入は成功しないので、本研究では哺乳類発現ベクター上のcDNAを導入し、A群細胞のUV抵抗性(【UV^r】)形質転換をおこすcDNAのクローニングを目的とした。
1.cDNAライブラリーpcDHFの作成。 ヒト正常線維茅細胞(HF)からpdy【A^+】mRNAをオリゴdTカラムで調整し、岡山・バーグ法でSV40プロモーターをもつ哺乳類発現ベクターpcDに組換え、全cDNAのpcDHFライブラリーを作成した。
2.A群XP細胞へのpcDHF DNAの導入と【UV^r】形質転換クローンの分離。
SV40永久株A群XP20S(SV)にpcDAF DNAを共沈法で導入し、発現期間をおいて2〜3回UV選択をし【UV^r】クローンを分離した。5×【10^8】非導入細胞から【UV^r】復帰変異はなく、【10^9】細胞(数回導入実験)から約100一次生存コロニーを得た。一過性発現と不安定クローンを再度除き、安定な【UV^r】転換クローン4株を得た。生存曲線・UDS解析から、いづれも部分転換形質を示し、その中XP20S(SV)pcD23は最も高い。親株の4倍の【UV^r】形質を示し、そのゲノムDNAは1コピーpcDの組込みを有し、二次導入で【UV^r】形質転換能を示した。
3.A群細胞に【UV^r】形質を与えるcDNA遺伝子のクローニング。pcD23ゲノムDNAの20kb断片のλEMBL4ライブラリーから、pcDベクター・プローブによって8陽性クローンを得た。その中λ3とλ9が親XP2OS細胞を【UV^r】に形質転換した。λ3の制限酵素地図を作成し、かつインサート断片をプローブとして、もやのpcDHFライブラリーより1個の特異的cDNA遺伝子を拾った。現在、塩茎配列の決定を行っている。A群遺伝子産物の同定とA群染色体遺伝子の探索,染色体局在,産物の作用機構などの研究が将来展望できる。
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