線虫C.elegans発生過程の遺伝子工学的研究

• Project/Area Number: 61228006
• Research Category: Grant-in-Aid for Special Project Research
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Institution: Nagoya University
• Principal Investigator: 小原 雄治 名大, 理学部, 助手 (70135292)
• Project Period (FY): 1986
• Project Status: Completed (Fiscal Year 1986)
• Budget Amount: ¥1,100,000 (Direct Cost: ¥1,100,000); Fiscal Year 1986: ¥1,100,000 (Direct Cost: ¥1,100,000)
• Keywords: 染色体walking / 染色体ライブラリー / 制限酵素地図 / オーバーラップクローン / コンピューター探索

Research Abstract

遺伝学の進んだ系では、染色体walking法などによってゲノムの特定領域の構成を知ることは、種々の遺伝子の単離、とりわけ発生分化に関わる遺伝子など簡便な検定法のないものに、大きな力となる。しかし通常の染色体walk-ing法は多大の労力を要する。線虫C.elegansは遺伝学が進んでおり、ゲノム長が比較的小さく(大腸菌の約20倍)。その約80%はユニーク配列である。本年度は、これらの特色を生かすべく、新しい方法論として染色体ライブラリークローンソーティング法を開発した。
本方法は、まずラムダファージベクターを用いて作成した染色体ライブラリーの十分な数の独立のクローンについて、極微量DNAを調製し、各種の制限酵素で部分分解し、右アームの端領域DNAをプローブにサザンハイブリダイゼーションを行う。右端から制限酵素切断部位までの距離に応じたバンドが、あたかも塩基配列のごとくあらわれるので、それぞれのバンドの位置をデジタイザーを用いて測定し、サイズマーカーとの相対位置から制限酵素部位を計算し、コンピューターに入力する。そのパターンをコンピューターを用いて比較し、重なりあうクローンを選別し、ゲノム全体にわたるクローンの順序づけを行うものである。結果的に全ゲノムの制限酵素地図ができあがる。
モデル実験として、大腸菌DNA(約4700kb)の染色体ライブラリーを解析し、本法の検討を行なった。約1000個のクローンの制限酵素地図を高能率に作成し多くのグループに並べかえた。各グループは、追加2000クローンを高密度に接種するプラークハイブリダイゼーション法を開発し、つなげていった。その結果、ほぼ完全な物理地図を作成した。
今後、本方法をC.elegansの染色体の特定領域に応用できるよう更に改良を行う予定である。