微生物酵素により合成したγ-グルタミルペプチドの動物脳における薬理作用機構

Research Project

Project/Area Number	61560118
Research Category	Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
Allocation Type	Single-year Grants
Research Field	発酵・醸造
Research Institution	Kyoto University
Principal Investigator	熊谷英彦京大, 農学部, 助教授 (70027192)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	矢野俊博京都大学, 農学部, 教務職員 (30135553) 山本憲二京都大学, 農学部, 助手 (70109049) 立木隆京都大学, 農学部, 助手 (60026573)
Project Period (FY)	1986
Project Status	Completed (Fiscal Year 1986)
Budget Amount *help	¥1,900,000 (Direct Cost: ¥1,900,000) Fiscal Year 1986: ¥1,900,000 (Direct Cost: ¥1,900,000)
Keywords	γ-グルタミルトランスペプチダーゼ / γ-グルタミルドーパ / アストログリオーマC6
Research Abstract	1.E.coli K12株のγ-グルタミルトランスペプチダーゼ(GGT)欠損株を取得し、GGTをコードする遺伝子(ggt)の染色体遺伝子上の位置を明らかにした。この結果を利用して、大腸菌染色体の遺伝子ライブラリーより、GGT高活性株を選択した。本株は野性株の5倍のGGT活性を示し、これを酵素源とすることにより、10lの培養液から約56倍の精製で50mgのGGT単一標品を得ることができた(収率40%)。 2.このようにして得られたGGT結晶標品を用いて、L-グルタミンとL-ドーパからのγ-グルタミルドーパの酵素合成を試み、その最適条件を検討した。その結果、L-ドーパ,200mM;グルタミン,200mM;NaCl,1M;ビタミンC,50mM;【Na_2】H【PO_4】-NaOH(pH11.0),100mM;GGT,250mU/mlから成る反応液を用いて、30℃で2時間反応させるとき、最大量である140mM(46mg/ml,総量6.18g)のγ-グルタミルドーパを生成せしめることができた。このようにして得たγ-グルタミルドーパをイオン交換カラムクロマトグラフィー等により精製し、絶品1.9g(収率30%)を得た。 3.γ-グルタミルドーパメチルエステルの酵素合成も試みたが、ドーパメチルエステルは、反応液中で加水分解され、そのγ-グルタミル化合物を得ることはできなかった。又γ-グルタミルドーパミンの酵素合成は検討中である。 4.ラット脳由来のアストログリオーマ細胞C6を培養し、インタクトな細胞がGGT活性を有することを明らかにした。また本細胞をパパイン処理した上澄液にGGT活性が存在することを確認した。 5.現在C6細胞を用いて、γ-グルタミルドーパの取り込みについて実験中であり、L-ドーパ取り込みとの比較、L-ドーパ取り込みに対するグルタチオンの添加効果、GGT阻害の影響等について詳細に検討する計画である。