thrombomodulinの理化学的生物学的諸性質ならびに病態生理学的意義

Research Project

Project/Area Number	61570576
Research Category	Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
Allocation Type	Single-year Grants
Research Field	Hematology
Research Institution	Tokyo Medical and Dental University
Principal Investigator	青木延雄医科歯科大, 医学部, 教授 (20048937)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	室橋郁生東京医科歯科大学, 医学部, 助手 (90182146) 広沢信作東京医科歯科大学, 医学部, 助手 (50143574) 宮坂信之東京女子医科大学, 医学部, 助教授 (30157622)
Project Period (FY)	1986
Project Status	Completed (Fiscal Year 1986)
Budget Amount *help	¥1,900,000 (Direct Cost: ¥1,900,000) Fiscal Year 1986: ¥1,900,000 (Direct Cost: ¥1,900,000)
Keywords	スロンボモデュリン / モノクロナル抗体 / プロテインC / スロンビン / 血液凝固の制御 / 血管内皮細胞 / 血管内凝固
Research Abstract	ヒト胎盤より、既にわれわれの報告した精製法(Thrombosis.Research 37:353,1985)によりthrombomodulin(以下TM)を精製し、その精製標品をマウス腹腔内に8週にわたり繰り返し注射し、さらに皮下に追加免疫を行った。免疫マウスの脾細胞をマウスミエローマ細胞と融合し、培養増殖,腹水産生さらにモノクロナル抗体の精製を常法に従って行った。得られた10クローンのうち、抗体価の高い4クローンをえらび、それらの性質を検索した。4クローンのうち1クローンはIgMを産生し、他はIgGクローンであった。IgGモノクロナル抗体の1つは、トロンビンTM複合によるプロテインCの活性化を阻止し、また、TMのトロンビン不活化をも阻止した。従って、このモノクロナル抗体は、TMのトロンビンとの反応部位を認識する抗体であることが示唆された。他の1つのIgGモノクロナル抗体は、TMのトロンビン不活化を抑制しなかったが、トロンビンTM複合体によるプロテインCの活性化を抑制した。他の抗体はTMの活性に影響を与えなかったが、ウエスターンブロッティングによりTMと反応することがたしかめられた。ヒト尿と血漿を、それぞれSDS-PAGEで分離したのち、これら抗体を用いてウエスターンブロッティングを行うと、尿中および血漿中に、還元下で分子量約5万と推定される可溶性TMが存在することが認められた。一方、尿をQAEセファデックスに吸着し洗滌し、1MNaClで溶出したのち、TM精製法を適用して得られた精製物は、抗TMモノクロナル抗体と反応し、またトロンビン活性を阻害し、トロンビンのプロテインC活性化を促進した。これらの活性は、活性を抑制する抗TMモノクロナル抗体にて阻害された。エピトークの異なる2種類のモノクロナル抗体を組合せたサンドウィッチ法によるELISAでTMを測定する方法を確立し、各種病態における血中および尿中のTMの変動の検索を開始した。