特発性血小板減少性紫斑病の血小板自己抗体に対する特異抗原の解析

Research Project

Project/Area Number	61570579
Research Category	Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
Allocation Type	Single-year Grants
Research Field	Hematology
Research Institution	Osaka University
Principal Investigator	椿尾忠博阪大, 医学部, 助手 (90144477)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	米沢毅大阪大学, 医学部, 講師 (50028560) 倉田義之大阪大学, 医学部, 講師 (80127224) 金山良男大阪大学, 医学部, 助手 (30158852)
Project Period (FY)	1986
Project Status	Completed (Fiscal Year 1986)
Budget Amount *help	¥1,600,000 (Direct Cost: ¥1,600,000) Fiscal Year 1986: ¥1,600,000 (Direct Cost: ¥1,600,000)
Keywords	特発性血小板減少性紫斑病 / 抗血小板モノクローナル抗体 / 血小板抗原
Research Abstract	1.マウス抗ヒト血小板モノクローナル抗体の作成。BALB/Cマウスをヒト血小板で免疫しその脾細胞とNS-1マウスミエローマ細胞を融合しハイブリドーマをえた。Glyceprotein(GP)【I】bあるいは【II】b/【III】aに対する抗体を4種類作成しえた。この内、OP72(抗GP【I】b抗体)を用いてITP患者血漿中の抗GP【I】b抗体の検出を行った。方法はOP-72を固相したマイクロウエルに血小板lysateを反応させてGP【I】bを結合させた。これに患者血漿を加え結合した抗体をELISAにて検出。ITP87例中3例に陽性を示し、これらの抗体がGP【I】b抗体であることをさらにイムノブロット法によって確認した。(臨床血液,印刷中)また、ITP血清中の血小板自己抗体に対応する血小板抗原の解析も並行して行い、ITP40例中2例の血漿中にGP【II】bに対する抗体を初めて検出しえた。(Brit;J.Haematol,in press) 2.ヒト抗血小板モノクローナル抗体の作成。慢性ITP摘脾例の脾細胞とhuman-mouse heteromyeloma cell間でハイブリドーマの作成を試みた。今までに2回施行し現在3回目が進行中である。培養上清のスクリーニングは血小板固相マイクロプレートを用いたELISAで行った。2回目の成績では、ウエル当り脾細胞で1×【10^5】個を分注した結果、2〜3週後にはハイブリドーマ形成率は100%を得た。1ウエル当りのコロニー数は9〜56個で平均20個であった。培養上清をIgGとIgMについて測定したところIgGは全ウエル陰性IgMは2.5%陽性であった。IgM陽性上清をさらにリンパ球に対する反応性を検討したところ陽性を呈したが、その内1つのウエルの上清は極めて反応が強く単に非特異反応と言い難いためクローニングを行い、さらにその上清について詳細な検討を試みつつある。この1年間でハイブリドーマ作製、抗体スクリーニング法などヒトモノクローナル抗体作製に向けての方法はほぼ確立しえた。