| Project/Area Number |
62480066
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| Research Category |
Grant-in-Aid for General Scientific Research (B)
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Research Field |
林産学
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| Research Institution | Tokyo University of Agriculture and Technology |
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Principal Investigator |
諸星 紀幸 東京農工大学, 農学部, 教授 (30015078)
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| Project Period (FY) |
1987 – 1989
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| Project Status |
Completed (Fiscal Year 1989)
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| Budget Amount *help |
¥6,000,000 (Direct Cost: ¥6,000,000)
Fiscal Year 1989: ¥500,000 (Direct Cost: ¥500,000)
Fiscal Year 1988: ¥1,000,000 (Direct Cost: ¥1,000,000)
Fiscal Year 1987: ¥4,500,000 (Direct Cost: ¥4,500,000)
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| Keywords | カワラタケ / ラッカ-ゼ / 白色腐朽菌 / リグニン分解酵素 / 遺伝子のクロ-ニング / cDNAクロ-ニング / 菌体外酸化酵素 / リグニン分解 / ラッカーゼ / フェノールオキシダーゼ / クローニング / mRNA / cDNAライブラリー。 / ラッカーゼIII |
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| Research Abstract |
前年度までの成果として、ラッカ-ゼIII遺伝子のλgt11ベクタ-を用いた組換えに成功し、cDNAライブラリ-の構築が出来た。本年度はcDNAライブラリ-より形質転換株のスクリ-ニングを行い、ラッカ-ゼIII由来のDNAを単離することにある。
まず、形質転換株のスクリ-ニングではλgt11ベクタ-に組込んだcDNA断片をin vitro packaging後、対数増殖期の大腸菌Y1090株に感染させ、ファ-ジの増殖を行った。この場合の組換え体ファ-ジ形成率は74〜92%であった。次にファ-ジにより形成されたプラ-グにニトロセルロ-スフィルタ-をのせ、産生されたタンパクをフィルタ-に移し取り、これにラッカ-ゼIII抗体を反応させ、さらに^<125>IプロテインAを反応させ、オ-トラジオグラフィ-により3種のポジティブクロ-ンを得た。
次に、得られたポジティブクロ-ンを再度回収し、新たな培養を繰返し、候補クロ-ンの増殖をはかった。このポジティブクロ-ンのDNAをミニライセ-ト法で抽出し、EcoRI及びKpnI、SacIで分解後、(^<32>P)dATPでKlenowラベルし、アガロ-スゲル電気泳動後、オ-トラジオグラフィ-分析を行った。その結果、挿入フラグメントのサイズは430bpであると推定された。ラッカ-ゼIIIタンパクの分子量は66,000であることから糖鎖含量を考慮に入れれば、約2kbpと考えられ、今回得られたクロ-ンは全遺伝子ではないが、部分構造である遺伝子をクロ-ニングすることが出来た。このことは基本的戦略には間違いはなく、実験は成功であったと言えるし、大きな成果であった。従って、将来スクリ-ニング回数を多くし、全長鎖を持つクロ-ンを得ることが次の目標となる。
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